酶工程第三章酶的生物合成法生产2013-2.ppt
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1、酶工程 Enzyme Engineering,林范学 ,1/50,2/150,2/50,酶的生产方法:,微生物细胞发酵产酶 植物细胞发酵产酶 动物细胞发酵产酶,提取分离法 生物合成法 化学合成法,生物合成法:,第三章 酶生物合成法生产,3/150,酶的生物合成(biosynthesis) 通过细胞的生命活动合成各种酶的过程 酶的生物合成法生产 经过预先设计,通过人工操作,利用微生物、植物及动物细胞的生命活动,获得所需酶的技术过程,称为酶的生物合成法生产,3/50,第三章 酶生物合成法生产,4/150,第三章 酶生物合成法生产,第一节 细胞的选择 第二节 培养基的配制 第三节 产酶工艺条件及其调
2、节控制 第四节 微生物发酵产酶 第五节 植物细胞培养产酶 第六节 动物细胞培养产酶,4/50,5/150,第一节 细胞的选择,优良产酶细胞应具备的条件 (1)酶的产量高 (2)容易培养和管理(生长速率高、营养要求低) (3)产酶稳定性好,不易退化 (4)利于分离提纯 (5)安全可靠,无毒性,6/150,一、微生物,常用的产酶微生物,7/150,一、微生物,微生物酶的种类 大众工业用酶:淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、纤维素酶和木聚糖酶,8/150,一、微生物,1、大肠杆菌(Escherichia coli) 谷氨酸脱羧酶:测定谷氨酸含量或用于生产氨基丁酸 天冬氨酸酶:催化延胡索酸加氨生
3、产L-天冬氨酸 青霉素酰化酶:用于生产新的半合成青霉素或头孢霉素 天冬酰胺酶:对白血病具有显著疗效 -半乳糖苷酶:用于分解乳糖或其他-半乳糖苷 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等:在基因工程等方面广泛应用。,9/150,一、微生物,2、枯草杆菌(Bacillus subtilis) 枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物 -淀粉酶 蛋白酶 -葡聚糖酶 5-核苷酸酶 碱性磷酸酶,10/150,一、微生物,3、链霉菌(Streptomyces) 葡萄糖异构酶:主要生产微生物 青霉素酰化酶 纤维素酶 碱性蛋白酶 中性蛋白酶 几丁质酶 16羟化酶:可用于甾体转化,11/150,一
4、、微生物,4、黑曲酶(Aspergillus niger) 可用于生产多种酶,有胞外酶也有胞内酶 糖化酶 -淀粉酶 酸性蛋白酶 果胶酶 葡萄糖氧化酶 过氧化氢酶,核糖核酸酶 脂肪酶 纤维素酶 橙皮苷酶 柚苷酶等。,12/150,一、微生物,5、米曲霉(Aspergillus oryzae) 糖化酶和蛋白酶的活力:传统的酒曲和酱油曲的制造中广泛应用 氨基酰化酶 磷酸二酯酶 果胶酶 核酸酶P,13/150,一、微生物,6、青霉菌(Penicillium) 产黄青霉(Penicillium chrysogenum) 葡萄糖氧化酶 苯氧甲基青霉素酰化酶 果胶酶 纤维素酶,桶青霉(Penicillium
5、 cityrinum) 5-磷酸二酯酶 脂肪酶 葡萄糖氧化酶 凝乳蛋白酶 核酸酶S1 核酸酶P1,14/150,一、微生物,7、木霉(Trichoderma) 纤维素酶:重要生产菌株,包含有Cl酶、Cx酶和纤维二糖酶等。 17-羟化酶:常用于甾体转化。,15/150,一、微生物,7、根霉(Rhizopus) 糖化酶 -淀粉酶 蔗糖酶 碱性蛋白酶 核糖核酸酶,脂肪酶 果胶酶 纤维素酶 半纤维素酶 11-羟化酶:用于甾体转化的重要菌株。,16/150,一、微生物,9、毛霉(Mucor) 蛋白酶 糖化酶 -淀粉酶 脂肪酶 果胶酶 凝乳酶,17/150,一、微生物,10、红曲霉(Monascus) -
6、淀粉酶 糖化酶 麦芽糖酶 蛋白酶,18/150,一、微生物,11、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 主要用于啤酒、酒类的生产 转化酶 丙酮酸脱羧酶 醇脱氢酶,19/150,一、微生物,12、假丝酵母(Candida) 脂肪酶 尿酸酶 尿囊素酶 转化酶 醇脱氢酶 17经化酶:可以用于甾体转化。,20/150,二、植物细胞,主要用于色素、药物、香精和酶等初级代谢产物的生产。,21/150,三、动物细胞,动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、多肽、酶等 酶:纤溶酶原激活剂(tPA)、胶原酶、尿激酶等。 产酶细胞 人黑色素瘤细胞 中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 小鼠骨髓瘤细胞 牛
7、内皮细胞,22/150,第二节 培养基的配制,培养基(culture medium)是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。,23/150,一、培养基的基本成分,1、碳源(carbon source) 能为细胞提供碳素化合物的物质。 细胞构成、酶的组成,也提供能源 微生物:淀粉、糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖 植物细胞:蔗糖 动物细胞:谷氨酰胺、谷氨酸,24/150,2、氮源(nitrogen source) 向细胞提供氮元素的营养物质。 蛋白质、核酸、酶的组成成分。 有机氮:蛋白质及其水解物,如蛋白胨、酵母膏等。 无机氮:含氮的无机物,如氨水、硫酸铵等。 动物细胞:氨基酸、
8、蛋白胨等有机氮 植物细胞:铵盐、硝酸银等无机氮 微生物: 异养型:有机氮 自养型:无机氮,25/150,3、无机盐(inorganic salt) 是提供细胞生命活动所必不可缺的各种无机元素,并对细胞内外的pH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。 大量元素(0.5mmol/L) : P ,S ,K,Na,Ca,Mg,Cl等元素 微量元素( 0.5mmol/L) : Cu, Mn, Zn, Mo ,Co,B,I,26/150,4、生长因素(growth factor) 即生长因子,是指细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。 氨基酸:蛋白质组分 嘌呤、嘧啶:核酸、辅酶、辅基的组分 维生素:起辅酶作用
9、生长激素:起细胞生长、分裂的调节作用,27/150,二、微生物培养基,用于微生物培养和发酵生产的各种培养基的总称。 碳源:淀粉或其水解物 氮源:含有有机氮和无机氮的混合氮源 无机盐和生长因子:根据需要添加,28/150,三、植物细胞培养基,1、植物细胞培养基特点(与微生物培养基的不同点) (1)植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐: 大量元素:P、S、N、K、Na、Ca、Mg等大量元素:浓度一般为1023103mg/L 微量元素:Mn、Zn、Co、Mo、Cu、B、I等:浓度一般为10-230 ng/L。 (2)植物细胞需要多种维生素和植物生长激素: 维生素:如琉胺素(VB1)、吡哆素(VB6)
10、、烟酸、肌醇:浓度一般为0.1100mg/L); 生长激素:生长素、分裂素:浓度一般为0.110mg/L, (3)植物细胞要求的氮源一般为无机氮源:即可以同化硝酸盐和铵盐。 (4)植物细胞一般以蔗糖为碳源:蔗糖的浓度一般为2%5%。,29/150,2、几种常用的植物细胞培养基 (1)MS培养基:MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。其特点是硝酸盐(硝酸钾、硝酸铵)的浓度比其他培养基高,广泛应用于植物细胞、组织和原生质体培养。 (2)B5培养基:B5培养基是1968年Gamborg等人为大豆细胞培养而设计的培养基。其主要特点是铵的浓度较低,适用于双
11、子叶植物特别是木本植物的组织、细胞培养。 (3)White培养基:White培养基是1934年由White为番茄根尖培养而设计的培养基。1963年作了改良,提高了培养基中MgSO4 的浓度,增加了微量元素硼(B)。其特点是无机盐浓度较低,适用于生根培养。 (4)KM-8P 培养基:KM-8P培养基是1974年为原生质体培养而设计的培养基。其特点是有机成分的种类较全面,包括多种单糖、维生素和有机酸,在原生质体培养中广泛应用。,30/150,3植物细胞培养基的配制 (1)大量元素母液:即是含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的无机盐混合液。由于各组分的含量较高,一般配制成10倍浓度的母液
12、。在使用时,每配制成1000mL培养液,吸取100mL母液。 (2)微量元素母液:即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的无机盐混合液。由于各组分的含量低,一般配制成100倍浓度的母液。在使用时,每配制1000mL培养液,吸取10mL母液。 (3)铁盐母液:由于铁离子与其他无机元素混在一起放置时,容易生成沉淀,所以铁盐必须单独配制成铁盐母液。铁盐一般采用螯合铁(Fe-EDTA)。通常配制成100倍(或200倍)浓度的铁盐母液,在使用时,每配制1000mL培养液,吸取10m1(或5mL)铁盐母液。 (4)维生素母液:是各种维生素和某些氨基酸的混合液。一般配制成100倍浓度的母液。在
13、使用时,每配制1000mL培养液,吸取10mL母液。 (5)植物激素母液:各种植物激素单独配制成母液。一般浓度为100 mg/L。使用时根据需要取用。由于大多数植物激素难溶于水,需要先溶于有机溶剂或者酸、碱溶液中,再加水定容到一定的浓度。,31/150,3植物细胞培养基的配制 (1)大量元素母液:含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的无机盐混合液。配制成10倍浓度的母液。 (2)微量元素母液:含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的无机盐混合液。配制成100倍浓度的母液。 (3)铁盐母液:由于铁离子与其他无机元素混在一起放置时,容易生成沉淀,所以铁盐必须单独配制成铁盐母液
14、。铁盐一般采用螯合铁(Fe-EDTA)。通常配制成100倍(或200倍)浓度的铁盐母液。 (4)维生素母液:是各种维生素和某些氨基酸的混合液。一般配制成100倍浓度的母液。 (5)植物激素母液:各种植物激素单独配制成母液。一般浓度为100 mg/L。使用时根据需要取用。由于大多数植物激素难溶于水,需要先溶于有机溶剂或者酸、碱溶液中,再加水定容到一定的浓度。,32/150,四、动物细胞培养基,动物细胞培养 体细胞 soma 从动物体内取出部分组织, 在一定条件下用胰蛋白酶消化处理, 然后分离得到 杂交瘤细胞 hybridoma 首先分离肿瘤细胞和免疫淋巴细胞, 再在一定条件下将肿瘤细胞和免疫 淋
15、巴细胞进行细胞融合,然后筛选得到,33/150,1. 动物细胞培养基的组成成分,(1)氨基酸 (2)维生素 (3)无机盐 (4)葡萄糖 (5)激素 (6)生长因子,34/150,1. 动物细胞培养基的组成成分,(1) 氨基酸 各种必需氨基酸(Lys, Phe, Leu, Ile, Val, Met, His, Try),以及Cys, Tyr, Gln等。其中谷氨酰胺为多数动物细胞作为碳源和能源利用,有些动物细胞则利用谷氨酸。 (2) 维生素 动物细胞培养所需的各种维生素,在含血清的培养基中一般由血清提供;在血清含量低的培养基中或者在无血清的培养基中,必需补充B族维生素,有的还补充维生素C。,3
16、5/150,1氨基酸 氮源作用 不能利用: 多肽、蛋白质等高分子聚合物。 利用:氨基酸等单体化合物。 12种是必需氨基酸:Arg、Cys、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、Val。 必须在培养基中添加,才能满足细胞的生长 谷氨酰胺:重要碳源和能源。,36/150,2维生素 作用:一类微量的小分子有机生物活性物,既不是细胞的物质基础,也不是能量物质,对代谢和生长起调节和控制作用。 水溶性维生素:B族维生素和维生素C 脂溶性维生素:维生素A、D、E、K四种。,37/150,3无机盐 必需添加含有大量元素的无机盐,如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO33-、
17、SO42-、Cl-、HCO3-等,主要用于调节培养基的渗透压。而微量元素一般由血清提供,在无血清培养基或血清含量低的培养基中,则需要添加铁(Fe)、铜(Cu)、锌(Zn)、硒(Se)等。 4葡萄糖 大多数动物细胞培养基中含有葡萄糖,作为碳源和能源使用。但是葡萄糖含量较高的培养基在细胞培养过程中容易产生乳酸。研究表明,在动物细胞培养中,细胞所需的能量和碳素来自谷氨酰胺。,38/150,3无机盐 作用:细胞代谢所需酶的辅基,调节酶活性,细胞构成成分; 参与生理电活动; 维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡。 胞外无机盐对维持正常生长环境很重要。,39/150,4葡萄糖 糖类提供细胞生长的碳源和能源,分
18、解后释放出能量ATP。不同细胞对葡萄糖利用相似,在无氧条件下还产生乳酸等有机酸。 不能利用:多糖、双糖、寡糖等聚合物。 利用:单糖单体化合物。 主要是葡萄糖,40/150,5激素 动物细胞培养过程中需要胰岛素、生长激素、氢化可的松等激素。其中,胰岛素可以促进细胞对葡萄糖和氨基酸的吸收和代谢;生长激素与促生长因子结合,有促进有丝分裂的效果;氢化可的松可促进细胞就着和增殖,然而当细胞浓度较高时,氢化可的松可抑制细胞生长并诱导细胞分化。动物细胞培养所需的激素一般在血清中已经存在,但在低血清或者无血清培养基中必需添加适当的激素。 6生长因子 血清中含有各种生长因子,可以满足细胞的需要。在无血清或者低血
19、清培养基中,需要添加适量的表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等。,41/150,5. 生长类因子与激素 作用:对细胞的生长有刺激作用 贴附因子:细胞的贴壁生长必需。 脂类化合物:必需的,类脂及其前体和血清常平行使用。 铁传递蛋白:离子载体。,42/150,2. 动物细胞培养基的配制,配制母液 如100倍浓度氨基酸母液、1000倍浓度维生素母液、100倍浓度葡萄糖母液(溶解于平衡盐溶液)等。 混合母液 在使用前,分别吸取一定体积的母液,混匀得到混合母液,膜过滤除菌后,冷冻备用; 使用母液 取一定体积的混合母液,用无菌的平衡盐溶液稀释至所需浓度。,43/150,确保完全溶解、不产生沉淀
20、 其他注意点: 如果采用无血清培养基,则需要补充各种激素和生长因子等组分 由于谷氨酰胺不稳定(在培养液中的半衰期,4时为3周,36.5时为1周),要单独配制并冷冻保存。,44/150,45/150,第三节 产酶工艺条件及其调节控制,选择性能优良的产酶细胞 控制好各种工艺条件 根据情况变化进行调节,46/150,酶生产的一般工艺流程,47/150,一、细胞活化与扩大培养,选育细胞 细胞保藏 斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法、低温保藏法、石蜡油保藏法等 保持细胞的生长、繁殖和产酶特性。 细胞活化 保藏的细胞接种到新鲜培养基上,在一定条件下进行培养,使细胞的生命活性得以恢复的过程。,48
21、/150,扩大培养 获得足够数量的优质细胞 培养基:含有较为丰富的氮源、碳源 扩大培养至细胞对数期,或孢子成熟期 接种量:1%10%,49/150,二、pH的调节控制,1、不同细胞,其生长繁殖的最适pH值有所不同。 细菌、放线菌:中性或碱性,pH6.58.0 霉菌、酵母菌:偏酸性,pH46 植物细胞:偏酸性,pH5.25.8 动物细胞:偏碱性,pH7.27.6,50/150,2、 细胞产酶最适pH值与生长最适pH值往往不同。 细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。 碱性蛋白酶:碱性(pH 8.59.0) 中性蛋白酶:中性或微酸性(pH 6.07.0), 酸性蛋白酶:酸性
22、(pH 46) 例外:有些酶在其催化反应的最适条件下,产酶细胞的生长和代谢可能受到影响 如枯草杆菌碱性磷酸酶,其催化反应的最适pH值为9.5,而其产酶的最适pH值为7.4,51/150,3、有些微生物可以同时产生若干种酶,在生产过程中,通过控制培养基的pH,可改变各种酶之间的产量比例。,黑曲霉 -淀粉酶 糖化酶 pH值中性 pH值偏酸性 ,米曲霉 蛋白酶 pH值碱性 碱性蛋白酶 pH值中性 中性蛋白酶 pH值偏酸性 酸性蛋白酶,52/150,4、随着细胞的生长、繁殖和新陈代谢产物的积累,培养基的pH值往往会发生变化。 这种变化的情况与细胞特性有关,也与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。
23、例如,含糖量高的培养基,由于糖代谢产生有机酸,会使pH值向酸性方向移动;含蛋白质、氨基酸较多的培养基,经过代谢产生较多的胺类物质,使pH值向耐性方向移动;以硫酸铵为氮源时,随着铵离子被利用,培养基中积累的硫酸根会使pH值降低;以尿素为氮源的,随着尿素被水解生成氨,而使培养基的pH值上升,然后又随着氨被细胞同化而使pH值下降;磷酸盐的存在,对培养基的pH值变化有一定的缓冲作用。在氧气供应不足时,由于代谢积累有机酸,可使培养基的pH值向酸性方向移动。,53/150,4、随着细胞的生长、繁殖和新陈代谢产物的积累,培养基的pH值往往会发生变化。,54/150,5、控制pH的方法: 调节培养基组分或比例
24、,保持一定的C / N比 C/N高:发酵液倾向酸性 C/N低:发酵液倾向碱性 添加缓冲液维持一定的pH; 调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围; 当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节,pH过低时,通过氮调节。,55/150,5、控制pH的方法:,56/150,三、温度的调节控制,1、不同的细胞有各自不同的最适生长温度 枯草杆菌:3437 黑曲霉:2832。 嗜热微生物:40-50,57/150,三、温度的调节控制,1、温度确定原则,58/150,有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同,而且往往低于生长最适温度。 这是由于在较低的温度条件下,可以提高酶所对应的mRNA的稳定性
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