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1、实验 血清钙、镁、磷的测定,西安医学院检验教研室,(一)血清钙测定,西安医学院检验教研室,血浆钙的存在形式,血钙,可扩散钙,非扩散钙,离子钙 可溶性不解离的钙盐,占血浆总钙60%,能透过毛细血管壁,与血浆蛋白结合,占血浆总钙40%,不能透过毛细血管壁,血浆中直接发挥生理作用的钙,相关知识,血钙的测定包括总钙测定和离子钙测定法。 总钙测定方法包括同位素稀释质谱法-决定性方法,原子吸收光谱法(AAS) 参考方法、分光光度法和络合滴定法等。,分光光度法中以邻甲酚酞络合酮法(OCPC)、甲基百里香酚蓝比色法和偶氮胂比色法(Arsenazo colorimetry)最常用。 离子钙测定目前临床最常用离子
2、选择电极法。,血清总钙测定 邻甲酚酞络合酮比色法,西安医学院检验教研室,掌握:OCPC法测定血清总钙的基本原理及提高准确性的方法。 熟悉:血清总钙测定的注意事项。 了解:总钙与离子钙的关系,实验目的,邻甲酚酞络合铜是金属络合染料,同时也是酸碱指示剂,在碱性条件下与钙络合,生成紫红色络合物。在600nm处有特征吸收,用8-羟基喹啉以消除标本中镁离子的干扰,与同样处理的的钙标准液比较即可测得出血钙含量。,原理,试剂与器材,1.R1:乙醇胺缓冲液。 2.R2:OCPC、8-羟基喹啉 3.氯化钙标准液:2.50mmol/L 工作液:取R1和R2等量混合即为工作液。 4.分光光度计,操作步骤,取试管3支
3、,按下表操作。,加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 工作液 3.0 3.0 3.0 蒸馏水 0.06 标准品 0.06 血清 0.06,充分混匀, 37水浴5分钟,在波长600nm处,以空白管调零,读取吸光度值。,计算,参考范围:2.032.54mmol/L,用血清或肝素抗凝血浆;不能用钙的螯合剂及草酸盐做抗凝剂的标本;胆红素可产生负干扰,可用血清对照消除。 镁离子也可与OCPC试剂产生紫红色络合物,因此,试剂中加入8-羟基喹啉是起络合镁离子的作用,以消除镁离子的干扰。,注意事项,pH对OCPC试剂的显色有很大影响,pH10.512时,反应的敏感性最好,所以选用pH11.0为宜。 此法对钙
4、离子有很高的敏感性,测定器皿要洁净,所有试剂应在聚乙烯瓶内保存;且配制试剂最好用高质量的去离子水或重蒸馏水。,临床意义,血钙增高常见于下列疾病:甲状旁腺机能亢进症、代谢性酸中毒、维生素D增多症、多发性骨髓瘤、恶性肿瘤等。 血钙降低见于下列疾病:甲状旁腺机能减退、慢性肾炎尿毒症、佝偻病和软骨病、大量输入柠檬酸盐抗凝血等。,西安医学院检验教研室,(二)血清镁测定,镁是人体内含量占第四位的金属元素,50%以磷酸盐、碳酸盐、氟化物的形式存在于骨骼中,45%在细胞内液,细胞外液中仅占5%。 血清中镁55%为离子型,15%与磷酸盐、枸椽酸盐等形成复合物,30%与蛋白结合。,相关知识,镁测定的参考方法是原子
5、吸收分光光度法, 国内外多数实验室采用金属显色染料直接显色和比色分析,其中甲基麝香草酚蓝、钙镁试剂广泛应用于镁的自动分析或手工操作。,血清镁测定钙镁试剂比色法,西安医学院检验教研室,掌握:钙镁试剂比色法测定血清镁的基本原理。 熟悉:有关试剂在反应中的作用。 了解:本法检测过程中的注意事项及血镁检测的临床意义。,实验目的,血清中镁在碱性环境中与Calmagite染料生成紫红色络合物,颜色的深浅与镁的浓度成正比。与同样处理的标准品比较,可求得镁的含量。溶液中加入EGTA可消除钙的干扰,使用表面活性剂可使蛋白胶体稳定,不必去除蛋白质而直接测定镁。,原理,试剂与器材,1R1:氢氧化钾、表面活性剂。 2
6、. R2: Calmagite 、EGTA 3. 氯化镁标准液:1.0mmol/L 工作液:取R1和R2等量混合即为工作液。 4.分光光度计,操作步骤,取试管3支,按下表操作。,加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 工作液 3.0 3.0 3.0 蒸馏水 0.03 标准品 0.03 血清 0.03,充分混匀, 室温放置3分钟,在波长546nm处,以空白管调零,读取吸光度值。,计算,参考范围:0.71.2mmol/L,1.溶血标本对本测定有明显的正干扰;脂血标本应去脂处理后,方可测定。 2.试剂宜置于塑料瓶中保存。显色剂已褪色则不可使用。 3.试剂防止污染,如自来水、器皿清洗不洁、试剂交叉污染
7、等。 4.溶液中的EGTA可消除钙的干扰;表面活性剂则可消除蛋白质的干扰。 5.适合于手工操作及大多数自动化分析仪,注意事项,临床意义,血清镁增高:服用治疗剂过量、肾脏疾病、内分泌疾病(甲状腺机能减退等)、多发性骨髓瘤等。 血清镁降低:镁摄入减少、镁由消化道丢失、镁由尿路丢失、内分泌疾病(甲亢、醛固酮增多症等)等。,西安医学院检验教研室,(三)血清磷测定,血清中的无机磷主要有H2PO4-和HPO42-两种磷酸盐阴离子。由于这两种阴离子在不同的pH环境中能快速相互转换,因而不能确切的说出无机磷酸盐的分子量。 目前常用的测定无机磷的方法有磷钼酸还原法、染料结合法、紫外分光光度法、黄嘌呤氧化酶比色法
8、、同位素吸收质谱法和原子吸收分光光度法。,相关知识,磷测定的决定方法是同位素稀释质谱法。 WTO推荐的常用方法是比色法。 目前我国推荐的常规方法是以硫酸亚铁或米吐尔(对甲基氨基酚硫酸盐)作为还原剂的还原钼蓝比色法。,血清磷测定还原钼蓝法,西安医学院检验教研室,掌握:还原钼蓝法测定血清磷的基本原理。 熟悉:血清磷测定的临床意义 了解:本法检测过程中的注意事项,实验目的,在酸性溶液中磷与钼酸铵起反应生成磷钼酸复合物,对甲基氨基酚硫酸盐(米吐尔)还原生成钼蓝,与同样处理的标准液进行比较,可求得血磷的含量。,原理,试剂与器材,1磷工作液:钼酸铵溶液、米吐尔溶液。 2. 磷标准液:磷酸二氢钾1.29mm
9、ol/L 3. 分光光度计,操作步骤,取试管3支,按下表操作。,加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 工作液 4.0 4.0 4.0 蒸馏水 0.1 标准品 0.1 血清 0.1,充分混匀, 37水浴5分钟,在波长650nm处,以空白管调零,读取吸光度值。,计算,参考范围:成人 0.971.62mmol/L 儿童 1.452.10mmol/L,1.血标本宜采用血清或肝素抗凝的血浆。应避免使用枸橼酸钠、EDTA和草酸盐作为抗凝剂。 2.标本应避免溶血,因为红细胞中含有高浓度的有机磷酯,在贮存期间易水解生成无机磷。 3.米吐尔试剂宜少量配置,放置时间不宜过长。 4.血清中磷是稳定的, 4可稳定数天,冷冻时可稳定数月。避免水分的蒸发,注意事项,临床意义,血清磷增高:肾小管对磷的重吸收增强(甲状旁腺机能减退);排泄障碍(慢性肾炎晚期、尿毒症);维生素D过多;多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病及骨骼愈合期等。,血清磷降低:肾小管对磷的重吸收受抑制(甲状旁腺机能亢进);维生素D缺乏(软骨病、佝偻病等);糖类吸收利用时,葡萄糖进入细胞内被磷酸化,磷可降低;肾小管变性病变时,肾小管重吸收磷发生障碍,血磷偏低;长期服用制酸类药物,也可使血磷降低。,
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