限制性内切酶小知识.ppt
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1、限制性核酸内切酶,制作人:* 日 期:*,简介,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 别名 Endodeoxyribonuclease 酶反应 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。,单位定义 在指明pH与37,在0.05mL反应混合物中,1小时消化1g的DNA的酶量为1单位。,定义和命名,DNA限制性内切酶: 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断的酶,即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用
2、,这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的,故名限制性内切酶(简称限制酶)。 限制性核酸内切酶的命名;一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成,第四个字母表示菌株(品系)。例如,从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H,在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶,可以编成不同的号,如HindII、HindIII,HpaI、HpaII,MboI、MboI等。,特征和种类,1限制与修饰现象 早在 50 年代初,有许多学者发现了限制与修饰现象,当时称作寄主控制的专一性(host cont
3、rolled specificity)。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性,其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题(表 2-1)。 l 在感染某一宿主后,再去感染其它宿主时会受到限制。 E.coli 菌株 噬菌体感染率 lK lB lC E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统,可排除外来的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果,此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ,维
4、护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用,可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤,胞嘧啶 C 成为 5 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。,2.限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子,限制与修饰系统主要分成三大类。表 2-1 是各种限制与修饰系统的比较。 型(type )限制与修饰系统所占的比例最大,达 93% 。型酶相对来说最简单,它们识别回文对称序列,在回文序列内部或附近切割 DNA ,产生带 3- 羟基和 5- 磷酸基团的 DNA 产物,需 Mg2+ 的存在才能发挥活性,相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主
5、要为 4-6bp ,或更长且呈二重对称的特殊序列,但有少数酶识别更长的序列或简并序列,切割位置因酶而异,有些是隔开的。 s 型(type s)限制与修饰系统,占 5% ,与 型具有相似的辅因子要求,但识别位点是非对称,也是非间断的,长度为 4-7bp ,切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。 型限制酶一般是同源二聚体(homodimer),由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成,每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体,修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成,分别作用于其中一条链,但甲基化的碱基在两条链上是不同的。 在 型限制酶中还有一类特殊的类型,该酶只切割双
6、链 DNA 中的一条链,造成一个切口,这类限制酶也称切口酶 (nicking enzyme),如 N.Bst NBI 。, 型(type )限制与修饰系统的种类很少,只占 1% ,能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。如 EcoK 和 EcoB。其限制酶和甲基化酶 (即 R 亚基和 M 亚基) 各作为一个亚基存在于酶分子中,另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基,分别由 hsdR、hsdM 和 hsdS 基因编码,属于同一操纵子(转录单位)。EcoK 编码基因的结构为 R2M2S。 EcoB 编码基因的结构为
7、R2M4S2 。 EcoB 酶的识别位点如下,其中两条链中的 A 为甲基化位点, N 表示任意碱基。 TGA*(N)8TGCT EcoK 酶的识别位点如下,其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点。 AAC(N)6GTGC 但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外,且无特异性。 型(type )限制与修饰系统的种类更少,所占比例不到 1% ,也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的,如 EcoP1 和 EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ,切割位点则在下
8、游 24-26bp 处。 在基因操作中,一般所说的限制酶或修饰酶,除非特指,均指 型系统中的种类。,表2-1:各种限制与修饰系统的比较,限制酶识别的序列,1限制酶识别序列的长度 限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基,最常见的为 6 个碱基(表2-2)。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时,它们可识别的序列在完全随机的情况下,平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点(44=256,46=4096)。以下是几个有代表性的种类,箭头指切割位置。 4 个碱基识别位点:Sau3A GATC 5 个碱基识别位点:EcoR CCWGG;Nci CCSGG 6 个碱基识别位点:EcoR
9、 GAATTC; Hind AAGCTT 7 个碱基识别位点:BbvC CCTCAGC; PpuM RGGWCCY 8 个碱基识别位点:Not GCGGCCGC Sfi GGCCNNNNNGGCC 以上序列中部 分字母代表的碱基如下。 R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T,2限制酶识别序列的结构 限制酶识别的序列大多数为回文对称结构,切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。 EcoR 和 Hind 的识别序列和
10、切割位置如下: EcoR GAATTC;Hind AAGCTT CTTAAG TTCGAA 有一些限制酶的识别序列不是对称的,如 AccBSCCGCTC(-3/-3) 和 BssSCTCGTG(-5/-1)。识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。 AccBS CCGCTC;BssS CTCGTG GGCGAG GAGCAC 有一些限制酶可识别多种序列,如 Acc 识别的序列是 GTMKAC ,也就是说可识别 4 种序列,其中两种是对称的,另两种是非对称的。 Hind 识别的序列是 GTYRAC 。 有一些限制酶识别的序列呈间断对称,对称序列之间含有若干个任意碱基。如 AlwN 和
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