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1、第三章 酶,Enzyme,第一节 酶概述 第二节 酶的命名与分类 第三节 酶的组成与结构 第四节 酶的作用机理 第五节 酶促反应动力学 第六节 变构酶、同工酶、诱导酶 第七节 酶的活力测定及分离提取,酶学研究历史,公元前两千多年,我国已有酿酒记载。 一百余年前,Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。 1877年,Kuhne首次提出Enzyme一词。 1897年,Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液,实现了发酵。 1926年,Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。 1982年,Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性,提出核酶(ribozyme)的概念。 1995年,Jack W
2、.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段,称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。,第一节 酶概述,一、酶是生物催化剂,二、酶的作用特点,三、酶的分布,四、酶的专一性,一、酶是生物催化剂,(一)酶的定义,酶是由活细胞产生的,在细胞内、外均有催化作用的特殊蛋白质或其他物质。,(二)酶的化学本质,1926年,Sumner从刀豆中得到脲酶结晶,证明是蛋白质。后来,先后获得胃蛋白酶,胰蛋白酶的结晶,1969年人工合成牛胰核糖核酸酶。 都证明是蛋白质。 1983年,发现RNA的催化功能,提出核酶的概念。 1995年,报道了具有DNA连接酶活性DNA片段,称为脱氧核酶。酶的本质是
3、蛋白质的概念受到了巨大的冲击。,1、反应前后,质与量不变,用量少。 2、缩短到达平衡的时间,不改变平衡点。 3、只能催化本来能进行的反应,即热力学上允许的反应。 4、降低反应活化能。,二、酶的作用特点,(一)与一般催化剂的相同点,(二)与一般催化剂的不同点,1、高效 酶促反应的速度比非酶促反应高1081020倍,比一般催化剂高1061013倍; 例如: 过氧化氢酶:每分钟催化500万分子H2O2 Fe 3+ :每500分钟催化1分子H2O2 2、高度专一 酶对底物有严格的选择性; 3、酶易失活,要求温和条件; 4、酶的活性可受到调节、控制; 5、酶催化常需辅助因子。,二、酶的作用特点,三、酶的
4、分布,酶分布在所有的细胞和组织中,相对隔离,各自发挥作用。 酶在生活细胞中产生,大部分酶在细胞内起催化作用,称为胞内酶。 有些酶被分泌到细胞外发挥作用,这类酶称为胞外酶。,四、酶的专一性,概念:酶的专一性,即特异性,指酶对它所作用的底物有严格的选择性。一种酶只能作用于某一种或某一类结构性质相似的物质。,酶专一性类型,酶对所催化的分子化学结构的特殊要求和选择。,(1)绝对专一性 有的酶对底物的化学结构要求非常严格,只作用于一种底物,不作用于其它任何物质。,1、结构专一性,四、酶的专一性,(2)相对专一性:有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些,它们能作用于一类化合物或一种化学键。,1
5、)键专一性:有的酶只作用于一定的化学键,而对键两端的基团并无严格要求。,1、结构专一性,四、酶的专一性,2)基团专一性:有的酶除要求作用于一定的键外,对键两端的基团还有一定要求,往往是对其中一个基团要求严格,对另一个基团则要求不严格。,2、立体异构专一性,(1)旋光异构专一性 底物具有旋光异构体(D型、L型)时,酶只能作用于其中的一种,(2)顺反异构专一性(几何异构专一性),四、酶的专一性,第二节 酶的命名与分类,一、酶的分类,二、酶的命名,一、酶的分类,国际生物化学会酶学委员会将酶根据反应性质分为六大类:,催化氧化还原反应,涉及H和电子的转移。如脱氢酶类。,1、氧化还原酶类(Oxido-re
6、ductases),乳酸脱氢酶催化乳酸的脱氢反应,一、酶的分类,例如:,2、转移(移换)酶类 (Transferases),催化分子间功能基团的转移。如转氨酶类。,谷丙转氨酶催化的氨基转移反应,一、酶的分类,3、水解酶类 (Hydrolases),催化水解反应。 如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。,脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应:,一、酶的分类,4、裂合(裂解)酶类( Lyases),催化非水解地除去底物分子中的基团及其逆反应的酶。如醛缩酶、脱氨酶、脱羧酶。,一、酶的分类,5、异构酶类(Isomerases),催化各种同分异构体的相互转化,即底物分子内基团或原子的重排过程。,6-磷
7、酸葡萄糖异构酶催化的反应:,一、酶的分类,6、合成酶类(Ligases or ynthetases),与ATP分解相偶联,并由二种物质合成一种物质。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。,例如丙酮酸羧化酶催化的反应: 丙酮酸 + CO2 + ATP + H2O 草酰乙酸 + ADP + Pi,一、酶的分类,A + B + ATP + H-O-H =AB + ADP +Pi,二、酶的命名,底物名称(底物1:底物2) 反应性质 酶 如:L乳酸:NAD+ 氧化还原 酶,1、系统命名,要求确切表明底物的化学本质及酶的催化性质。,命名原则:,(1)根据作用底物:如淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶等。 (2)根据反
8、应性质:如水解酶、脱氢酶、转氨酶等。 (3)二者结合:如乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶等。 (4)再加上酶的来源、特性:如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、酸性磷酸酯酶、碱性磷酸酯酶等。,2、惯用名,常依据酶所作用的底物和反应类型命名。,二、酶的命名,命名原则:,第三节 酶的组成与结构,一、酶的组成,二、酶的结构,一、酶的组成,单纯蛋白酶:属于简单蛋白质,酶的活性仅仅决定于它的蛋白质结构。如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。,结合蛋白酶:属于结合蛋白质,这些酶其蛋白质部分称之为酶蛋白,非蛋白组分称为辅助因子,酶蛋白和辅因子单独存在均无催化活性或活性很弱,结合在一起才表现出明显的酶活性。如:转氨酶、乳酸脱氢酶等。,辅
9、酶:与酶蛋白结合较松,可透析除去。 辅基:与酶蛋白结合较紧,不能透析除去。 金属离子:与酶的结合,有的松,有的紧。,一、酶的组成,辅酶、辅基往往是由维生素参与形成的小分子有机物。,维生素是维持机体生命活动不可缺少的一类小分子化合物,它既不是生物体构成成分,也不是能量物质,之所以对生命活动如此重要,是因为维生素是辅酶或辅基的组成成分,参与体内代谢过程。,(一)维生素,一、酶的组成,1、脂溶性维生素,一、酶的组成,(一)维生素,2、水溶性维生素,一、酶的组成,(一)维生素,一、酶的组成,(二)几个重要的辅助因子,1、TPP 焦磷酸硫胺素(含VB1),是脱羧酶的辅酶,催化丙酮酸或酮戊二酸的氧化脱羧反
10、应,又称为脱羧辅酶。,焦磷酸硫胺素(TPP),FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)和FMN(黄素单核苷酸)是核黄素(维生素B2)的衍生物。它们在脱氢酶催化的氧化-还原反应中,起着电子和质子的传递体作用。,2、FAD、FMN(含VB2),FMN,一、酶的组成,(二)几个重要的辅助因子,NAD+ (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,又称为辅酶I)和NADP+ (烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸,又称为辅酶II )是维生素烟酰胺的衍生物,它们是多种重要脱氢酶的辅酶。,一、酶的组成,3、NAD、NADP(含VB5),(二)几个重要的辅助因子,辅酶A(泛酰巯基乙胺腺苷二磷酸)是乙酰化酶的辅酶,重要生理功能是传递酰基。,一、酶的组成
11、,4、CoASH(含VB3),CoA,(二)几个重要的辅助因子,一、酶的组成,5、磷酸吡哆醛(胺)(含VB6),磷酸吡哆醛是氨基酸转氨作用、脱羧作用和消旋作用的辅酶。 转氨:通过醛、胺转化,转移氨基。,(二)几个重要的辅助因子,一、酶的组成,6、硫辛酸,硫辛酸是少数不属于维生素的辅基,是丙酮酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶的辅基,作用是递氢和递酰基。有两种形式:即硫辛酸(氧化型)和二氢硫辛酸(还原型)。,(二)几个重要的辅助因子,一、酶的组成,生物素是多种羧化酶的辅酶。功能是作为CO2的递体,在生物合成中起传递和固定CO2的作用。,7、生物素(VB7),(二)几个重要的辅助因子,一、酶的组成,叶酸的还
12、原产物四氢叶酸是转一碳单位酶的辅酶,主要作用是作为一碳基团如-CH3, -CH2-, -CHO 等的载体,参与多种生物合成过程。,8、叶酸(VB11),(二)几个重要的辅助因子,一、酶的组成,维生素B12辅酶又称为氰钴胺素,主要功能是作为变位酶的辅酶,催化底物分子内基团(主要为甲基)的变位反应。,9、维生素B12,10、维生素C,在体内参与氧化还原反应;羟化反应;是一种很好的还原剂。人体不能合成。,(二)几个重要的辅助因子,一、酶的组成,11、GSH (还原型谷胱甘肽),在氧化还原反应中传递氢。,12、铁卟啉(血红素),在氧化还原反应中递电子。,辅酶Q又称为泛醌主要作为线粒体呼吸链氧化-还原酶
13、的辅酶,在酶与底物分子之间传递氢。,13、辅酶Q,(二)几个重要的辅助因子,一、酶的组成,(三)辅酶辅基与维生素及核苷酸的关系,辅酶在催化反应过程中,直接参加了反应。 每一种辅酶都具有特殊的功能,可以特定地催化某一类型的反应。在反应中起运载体的作用,传递电子、质子或其它基团。 同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶。 一般来说,全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型(反应专一性),而酶蛋白则决定了所催化的底物类型(底物专一性)。,一、酶的组成,(四)辅酶/辅基的作用特点,一、酶的组成,(五)酶分子中的金属离子,根据金属离子与酶蛋白结合程度,可分为两类:金属酶和金属激活酶。,金属离子的作用
14、:稳定酶的构象; 参与催化反应,传递电子;在酶与底物间起桥梁作用;中和阴离子,降低反应中的静电斥力。,金属酶(metalloenzyme):酶蛋白与金属离子结合紧密。 金属激活酶(metal-activated enzyme) :金属离子为酶的活性所必需,但与酶的结合不紧密。,二、酶的结构,(一)根据酶蛋白结构上的特点,酶分为:,1、单体酶:仅由单一肽链组成的具有完全催化活性的酶。 2、寡聚酶:由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。 3、多酶络合物: 功能相关的几个酶嵌合成的聚合体、分子量几百万以上,更有利于一系列反应的进行。 4、多酶体系:有机体内,催化某一代谢途径总是由许多酶组成连续
15、的体系,这一代谢途径中的所有酶,通过许多连续的中间代谢物,形成不可分割的庞大酶系 5、多功能酶或串联酶:一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合,多种不同催化功能存在于一条多肽链中,这类酶称为多功能酶。,(二)活性中心(active site),二、酶的结构,活性中心:酶分子中直接与底物结合,并和酶催化作用直接相关的部位。或酶与底物结合并表现催化作用的空间区域。,1、结合部位(Binding site) 酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。 结合部位决定酶的专一性,二、酶的结构,(二)活性中心(active site),结合部位,酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位 催化部
16、位决定酶所催化反应的性质,二、酶的结构,(二)活性中心(active site),2、催化部位(catalytic site),活性中心的必需基团:结合、催化。 调节部位的必需基团 维持三维空间结构的必需基团 其它必需基团,活性中心的常见基团:His的咪唑基,Ser的羟基,Cys的巯基,Glu的羧基,二、酶的结构,必需基团:酶分子中有些基团若经化学修饰则活性丧失,这些基团称为必需基团。,(二)活性中心(active site),活性中心,3、酶活性中心的结构特点,二、酶的结构,(二)活性中心(active site),(1)酶蛋白多肽链经过盘绕折叠形成特定的空间结构,使有关的aa形成微区,活性
17、中心只占酶分子总体积的很小一部分,往往只占整个酶分子体积的1%-2%。 (2)酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂隙(crevice)内。裂隙内是一个相当疏水的环境,从而有利于同底物的结合。活性中心一般为低介电区(非极性环境、或疏水区) (3)底物靠许多弱的键力与酶结合。 (4)酶的活性部位是一个三维实体,具有三维空间结构。,胰凝乳蛋白酶的活性中心,活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser195,第四节 酶的作用机理,一、催化作用的本质,二、E与S的结合,三、酶高效催化的机理,四、酶作用机理实例胰凝乳蛋白酶,五、酶原激活,一、催化作用的本质,提高活化分子数量的途径: 对反应体
18、系加热、照射; 降低活化能,(一)分子活化能,在反应体系中,任何反应分子都有进行化学反应的可能,但只有能量达到或超过某一限度(能阈)的活化分子,才能在碰撞中起化学反应。 能阈活化能,(二)中间产物学说,酶催化作用的本质降低活化能。目前比较好的解释是中间产物学说。,许多实验事实证明了ES复合物的存在。ES复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。,一、催化作用的本质,酶促反应降低活化能,二、E与S的结合,(一)结合力:离子键、H键、范德华力、共价键,认为酶和底物的结合如钥匙与锁的关系 S的结构与酶活性中心结构完全吻合。可解释绝对 专一性,不好解释相对专一性。,(二)结合方式,1、锁钥学说(Emil.
19、Fischer于1890年提出 ),2、诱导契合学说(1958年D.E.Koshland提出),认为E活性中心结构与S结构不一定完全吻合 E构象受S诱导而变构,二者结合。反应后,E构象复原。,二、E与S的结合,(二)结合方式,酶与底物的诱导契合,三、酶高效催化的机理,底物分子结合到酶的活性中心,一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加,有利于提高反应速度;,(一)邻近和定向效应,邻近效应,定向效应,另一方面,由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用,使底物分子中参与反应的基团相互接近,并被严格定向定位,使酶促反应具有高效率和专一性特点。,(二)张力和变形,E与S诱导契合过程中,E受S诱
20、导而变构,同时变化的E分子使S分子中的敏感键产生“张力”或“变形”,使敏感键易于断裂。,三、酶高效催化的机理,(三)酸碱催化,酸-碱催化是通过瞬时向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态,加速反应的一类催化机制。,三、酶高效催化的机理,酶分子中可以作为广义酸、碱的基团,His 是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。,(四)共价催化(covalent catalysis),E与S形成一个反应活性很高的不稳定的共价中间产物,加快反应。 共价催化的最一般形式是催化剂的亲核基团对底物中亲电子的碳原子进行攻击,形成共价中间物。,酶分子中的亲核基团(孤对电子的供体): His 的咪唑基,Cys
21、 的巯基,Asp 的羧基,Ser 的羟基等。,亲电子基团(孤对电子的受体):H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+,三、酶高效催化的机理,(五)微环境的影响,三、酶高效催化的机理,在非极性环境中两个带电基团之间的静电作用比在极性环境中显著提高。 酶活性中心处于一个非极性环境中,从而有利于同底物的结合。 底物的敏感键易与酶的催化基团形成很大的反应力,加快反应速度。,酶活性中心是低介电区,四、酶作用机理实例胰凝乳蛋白酶,1、酶原由245个AA残基组成,分子量25000,大小514040。 2、接受底物非极性疏水口袋 3、专一性:水解羧基端具有芳香族AA的肽键。 4、活性中心:Asp102 His
22、57 Ser195,(一)胰凝乳蛋白酶的特点,Naa1aa2C 芳香族AA Trp、Tyr、Phe,胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的活性中心,胰凝乳蛋白酶的底物结合部位,1、通过电荷转移,使Ser有更强的亲核力。,(二)胰凝乳蛋白酶的作用机理,四、酶作用机理实例胰凝乳蛋白酶,2、形成酰化酶,放出产物P1,(二)胰凝乳蛋白酶的作用机理,四、酶作用机理实例胰凝乳蛋白酶,3、脱酰(水解)形成产物P2,(二)胰凝乳蛋白酶的作用机理,四、酶作用机理实例胰凝乳蛋白酶,酶原激活的实质:酶活性中心的形成或暴露过程。,五、酶原激活,酶原:某些酶(如消化酶)初合成时没有活性,这些没有活性的酶的前体称为酶
23、原。,酶原激活:无活性的酶原变成有活性的酶的过程。,酶原激活的意义:在特定的环境和条件下发挥作用;避免细胞自身消化;有的酶原可以视为酶的储存形式。,酶原激活的机理:,酶 原,一个或几个特定的肽键断裂,水解掉一个或几个短肽,五、酶原激活,在特定条件下,分子构象发生改变,形成或暴露出酶的活性中心,第五节 酶促反应动力学,一、酶促反应速度的测量 二、酶浓度对酶促反应速度的影响 三、底物浓度对酶促反应速度的影响 四、PH对酶促反应速度的影响 五、温度对酶促反应速度的影响 六、激活剂对酶促反应速度的影响 七、抑制剂对酶促反应速度的影响,一、酶促反应速度的测量,酶促反应速度可表示为: 单位时间内底物的消耗
24、量; 单位时间内产物的生成量。,引起酶反应速度降低的原因: 底物浓度的降低;酶的部分失活;产物对酶的抑制;产物增加引起的逆反应速度的增加等,研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准。,二、酶浓度对酶促反应速度的影响,反应条件固定且SE时= K E,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,在其他因素不变的情况下,底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。,(一)S对的影响,在底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比,反应为一级反应。=kS 随着底物浓度的增加,反应速度不再成正比例加速;反应为混级反应。 当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加,达最大速度;反应为零级反应。=Vmax,(二)米氏方程,S:底
25、物浓度 V:不同S时的反应速度 Vmax:最大反应速度 m:米氏常数,Michaelis和Menten根据中间产物学说推导了能够表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的数学方程式,即米曼氏方程式,简称米氏方程式。,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,1、米氏方程推导的基础 中间产物学说,(二)米氏方程,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,2、米氏方程推导的前提,3、米氏方程推导的过程,游离酶浓度=E-ES ES生成速度=k1(E-ES) S ES分解速度=k2ES+ k3ES 当稳态时: ES生成速度=ES分解速度 k1(E - ES) S = k2ES + k3ES,(二)米氏方程,三、底物浓度对
26、酶促反应速度的影响,米氏方程反映了: 当SKm时,V=(Vmax/Km) S,即v与S成正比 当SKm时,VVmax,即S增加而v不变,E被底物饱和。,4、米氏方程解释,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,(二)米氏方程,当反应速度为最大反应速度一半时,Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度,单位是mol/L。,1、Km值的推导,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,(三)米氏常数Km,(三)米氏常数Km,2、米氏常数Km的意义,物理意义:Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 不同的酶具有不同Km值,它是酶的一个重要的特征物理常数,只与酶的性质有关,而与其浓度无关。
27、Km值只是在固定的底物,一定的温度和pH条件下,一定的缓冲体系中测定的,不同条件下具有不同的Km值。,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,Km值近似等于ES的解离常数,可表示酶与底物之间的亲和力:Km值大表示亲和程度小,酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。 (同一种酶有几种底物就有几个Km值,从km可判断酶的专一性和天然底物。 Km最小的底物,通常就是该酶的最适底物,也就是天然底物。),所以1/Km表示形成ES的趋势大小,(三)米氏常数Km,2、米氏常数Km的意义,三、底物浓度对酶促反应速度的影响, km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。,(当丙酮酸浓度较低时,Km
28、值小的酶反应比较占优势),(三)米氏常数Km,2、米氏常数Km的意义,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,若已知某个酶的Km值,可以计算在某一个底物浓度时,反应速度相当于最大反应速度的百分率。,(三)米氏常数Km,2、米氏常数Km的意义,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,Km和米氏方程的实际应用,(三)米氏常数Km,2、米氏常数Km的意义,三、底物浓度对酶促反应速度的影响, 物理意义:反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度。, 是酶在一定条件下的特征物理常数,通过测定Km的数值,可鉴别酶。, 可用作酶与底物亲和能力的度量指标:Km越大、亲和力越小;Km越小、亲和力越大, 已知Km的情况下,应
29、用米氏方程可计算任意s时的v,或任何v下的s。(用Km的倍数表示),已知某酶的Km值为0.05molL-1,要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80时底物的浓度应为多少?,练习题,1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax,1)双倒数作图法又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法,3、米氏常数 Km 的测定,(三)米氏常数Km,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,2)v-v/S作图法 (Eadie-Hofstee),将米氏方程改写:,3、米氏常数 Km 的测定,(三)米氏常数Km,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,3)Hanes-Woolf作图法,3、米氏常数Km的
30、测定,(三)米氏常数Km,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,4)Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图,将米氏方程改写为:,3、米氏常数Km的测定,(三)米氏常数Km,三、底物浓度对酶促反应速度的影响,四、pH对酶促反应速度的影响,在一定的pH下, 酶具有最大 的催化活性,通常称此pH为 最适pH。 过酸或过碱影响酶蛋白的 构象,使酶变性失活。 影响酶分子中某些基团的 解离状态(活性中心的基团 或维持构象的一些基团) 影响底物分子的解离状态,最适pH不是酶的特征常数,受E的纯度, 底物与缓冲液种类、浓度的影响。,最适温度 (optimum temperature):酶促反
31、应速度最快时的环境温度。它不是酶的特征性常数,温度升高,酶促反应速度加快。 温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性,导致酶活性降低甚至丧失。 大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。 最适T,不是酶的特征常数,它与酶作用时间的长短、底物种类以及PH有关。,五、 温度对酶促反应速度的影响,金属离子:K+、Na+、Mg2+、 Cu2+、 Mn2+ 、 Zn2+ 、 Se3+、Co2+、 Fe2+,六、激活剂对酶促反应速度的影响,凡能提高酶活性的物质,都称为激活剂(activator),类别,阴离子: Cl-、Br-,有机分子还原剂:抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、 金属螯合剂:ED
32、TA,七、抑制剂对酶促反应速度的影响,失活作用:凡使酶蛋白变性而引起酶活力丧 失的作用。,抑制作用:使酶活力下降,但并不引起酶蛋白 变性的作用。此作用使一部分酶的必需基团 或辅助因子失活(活力变小)。,(一)不可逆抑制(irreversible inhibition),I与E共价结合,是一不可逆反应,二者结合后,不能透 析除去抑制剂,使酶永久失去活力,称为不可逆抑制作用,常见不可逆抑制剂:烷化剂、酰化剂、氧化剂、有机磷、 有机贡、氰化物、氮化物、重金属。,七、抑制剂对酶促反应速度的影响,解毒 - - - 解磷定(PAM):,例2 有机磷杀虫剂不可逆抑制羟基酶的活性中心,例1 碘乙酸、碘乙酰胺、
33、对氯汞苯甲酸对巯基酶的不可逆抑制 E-SH+ICH2COOHE-S-CH2COOH+HI,(一)不可逆抑制(irreversible inhibition),有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯,(二)可逆抑制(reversible inhibition),I与E非共价结合,为可逆反应,透析能除去抑制剂使酶恢 复活力,引起酶活性暂时性丧失,称为可逆抑制作用。,类型: 竞争性抑制 (competitive inhibition) 非竞争性抑制 (non-competitive I.) 反竞争性抑制 (uncompetitive I.),七、抑制剂对酶促反应速度的影响,1、 竞争性抑制,抑制剂的化学结构与底
34、物相似,因而能与底物竟争与酶活 性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后,底物被排斥在 反应中心之外,其结果是酶促反应被抑制了。,(二)可逆抑制(reversible inhibition),七、抑制剂对酶促反应速度的影响,竞争性抑制通常可以 通过增大底物浓度, 即提高底物的竞争能 力来消除。,竞争性抑制反应模式,Km 变大 Vmax不变,丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶,琥珀酸,磺胺类药物的抑菌机制: 与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶,竞争性抑制的特点,I与S结构类似,竞争酶的活性中心,排斥性抑制 加大底物浓度可以消除抑制 动力学特点:Vmax不变,表观Km增大 曲线图:有I比无I曲线下移, 但最
35、高点相同。 双倒数曲线图:有I比无I斜率增 大,并在纵轴交一点。,2、非竞争性抑制,底物与抑制剂可同时结合在酶的不同部位上,引起酶分子构 象变化,并导致酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞 争与活性中心的结合,所以称为非竞争性抑制剂。,(二)可逆抑制(reversible inhibition),七、抑制剂对酶促反应速度的影响,由于 EI 和 ESI 消耗一 部分酶,Vmax下降。,非竞争性抑制反应模式,Km不变;Vmax减小,重金属离子(Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+) 金属络合剂(EDTA、F-、CN-、N3-),非竞争性抑制的特点,抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合,底物与抑制剂
36、之间无竞争关系,是一种旁若无人式抑制。 提高底物浓度,不能消除抑制作用。 动力学特点:Vmax降低,表观Km不变。 曲线图:有I比无I下移。 双倒数曲线图:有I斜率增大,并在横轴上交一点。,3、反竞争性抑制,抑制剂只能与酶和底物的中间复合物结合,抑制酶活性。,反竞争性抑制的作用模式:,(二)可逆抑制(reversible inhibition),七、抑制剂对酶促反应速度的影响,举例氰化物或肼对芳香硫酸酯酶的抑制,第六节 变构酶、同工酶、诱导酶,一、变构酶(别构酶)(allosteric enzyme),当底物或效应物与酶分子的相应部位可逆地结合后,会引起酶分子构象改变,从而改变酶的催化活性,这
37、种效应称变构效应。具有变构效应的酶称变构酶。,(一)变构酶的概念,凡能使酶分子发生变构作用的物质称为效应物 (effector),通常为小分子代谢物或辅因子。,使酶活性增加的物质称为正效应物(positive effector)或变构 激活剂;反之称负效应物(negative effector)或变构抑制剂。,(二)变构酶的特点,1、一般是寡聚酶,除有活性部位外,还有与调节物结合的调节部位(变构部位)。,2、具有变构效应:当底物或效应物和酶分子上的相应部位结合后,会引起E分子构象的改变,从而影响E的催化活性。,3、大多数变构酶促反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏曲线,多数为S型。,5、变构
38、酶分子中一个活性部位能影响同一分子的另一个活性部位。,4、变构酶常是系列反应酶系统的第一个酶,或处于代谢途径分支上的酶。,一、变构酶(别构酶)(allosteric enzyme),(三)变构酶的变构调节实例,天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)所催化的反应,ATP: 正变构剂 CTP: 负变构剂,一、变构酶(别构酶)(allosteric enzyme),具有正协同效应,酶分子结合一分子底物后,酶的构象发 生变化而使酶分子上其它的底物结合部位对后续的底物分 子的亲和力增强,而大大地加快了反应速度。,二、同工酶 (isoenzyme),定义:同工酶是指催化相同的化学反应,而酶蛋 白的分子结构理化
39、性质乃至免疫学性质不同的一 组酶。或能催化相同化学反应的数种不同分子形 式的酶。,生理及临床意义 在代谢调节上起着重要的作用; 用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征; 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断; 同工酶可以作为遗传标志,用于遗传分析研究。,二、同工酶 (isoenzyme),三、诱导酶(induced enzyme),第七节 酶的活力测定及分离提取,一、酶活力的测定,酶的活力单位是衡量酶活力大小的尺度,指特定条件下酶促反应在单位时间内生成一定量的产物或消耗一定数量的底物所需要的酶量。,(一)酶活性测定的主要指标:活力单位,国际单位(IU):在特定的条件下,每分钟催化1mol底物转化为产
40、物所需的酶量为一个国际单位。,kat与IU的换算: 1Kat =6107 IU ;1 IU=16.6710-9 kat,一、酶活力的测定,Katal(简称kat):kat是指在特定条件下,每秒钟使 mol底物转化为产物所需的酶量。,淀粉酶可用每小时催化1克可溶性淀粉液化 所需要的酶量来表示。,(一)酶活性测定的主要指标:活力单位,一、酶活力的测定,如GPT的King氏单位,100mL血清与足量的丙 氨酸、-酮戊二酸在37保温1h,每生成 1mol 丙酮酸称为一个单位。,(二)酶纯度测定的主要指标:比活力,酶的比活力可表示酶制剂的纯度。在酶的提纯过程 中,随着酶逐步被纯化,E的总活力数会减少,但
41、比 活力却渐渐增加,比活力越高,表明E愈纯。,一、酶活力的测定,酶的比活力:,1mg蛋白质中所含的U数;,1Kg蛋白质中所含的Kat数。,单位质量样品中的酶活力;,要求:测定初速度; 最适条件; SE。,(三)活力测定条件,一、酶活力的测定,二、酶的分离提取(自学),称取25 mg 蛋白酶制剂,配制成25 ml酶溶液,从中取出0.1 ml酶液以酪蛋白为底物,用Folin酚比色法测定酶活力,得知每小时产生1500g酪氨酸,另取2 ml酶液,用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2 mg。若以每分钟产生1g酪氨酸的酶量为一个活力单位。 计算: (1)每亳升酶液中所含的蛋白质及活力单位数(2)比活力 (3)一克酶制剂的总蛋白含量及总活力,练习题,酶只有与底物结合后才与抑制剂结合,从而导致酶活性下降。,ESI,ES,P+ E,E+S,+ I,(3)反竞争性抑制,反竞争性抑制的米氏公式,KmS(1+I/Ki),反竞争性抑制的双倒数作图,Km减小 Vmax减小,
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