第4章-12B基因工程.ppt
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1、第四章 基因工程原理 基因工程的基本工具 Gene Engineering,定 义,基因工程:对生物体遗传信息的基本单元基因进行人工改造、干预和定向转移,其技术特征是将不同种类生物的基因或同种生物体的不同基因按照人们的意愿在体外进行拼接重组和变异,通过载体-宿主系统转入另一种生物体内,使之能按照人们的意愿稳定遗传、复制和表达,实现按照人们的意愿,改造生物的遗传特性,创造出生物的新性状的目的。,基因工程基础核酸,http:/ 基因工程菌的构建与培养,一、工程菌简介,基因工程菌: 微生物为操作对象,通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。 种类: 细菌和酵母是重要的
2、表达重组药物的制药生物。,1、生产药物,表(续),表(续),2、生产限制性内切酶,已商品化400多种,EcoRI GAATTC EcoRV GATATC BamHI GGATCC BglII AGATCT BstI GGATCC HindII AAGCTT HpaI GTTAAC KpnI GGTACC MboI GATC,3、生产生物小分子, 合成Vc,双(多)菌发酵 单菌发酵, 合成靛蓝 蓼兰叶提 化学合成 重组大肠杆菌生产, 生产氨基酸, 合成新的抗生素,4、生产生物多聚体,足丝粘性蛋白 蓝贻贝 强度特别高、防水 生物合成橡胶 蔗糖 17酶反应 可降解塑料 PHA、PHB,基因工程在生物
3、工艺中的应用,筛选和鉴定具有重要生理功能或重要用途的目的基因; 筛选、修饰和重组构建基因表达的转录调控元件和蛋白质生物合成的翻译调控元件; 通过目的基因与载体分子重组,利用载体分子的扩增提高目的基因在受体细胞中的剂量来提高表达水平; 工程菌的稳定增殖和目的基因的稳定表达; 基因表达产物的后处理等;,大规模生产生物活性物质,工程细胞,基因工程 蛋白质工程 途径工程,发酵工程 细胞工程,分离工程,酶,酶工程,分 离 工 程,天然细胞,天然细胞,生物活性物质,基因工程的基本形式,第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程,第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程,第三代基因工程
4、代谢信息途径的修饰重构 途径工程,第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程,3 基因工程的基本条件,C 用于基因转移的受体菌或细胞,B 用于基因克隆的载体,A 用于核酸操作的工具酶,基因工程的主要操作步骤,http:/ 用于核酸操作的工具酶,3 基因工程的基本条件,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸酶,核酸修饰酶,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,识别双链DNA分子中的特定序列,并切割DNA双链,主要存在于原核细菌中,帮助细菌限制外来DNA的入侵,细菌的限制与修饰作用,hsd R:编码限制性核酸内切酶,hsd M:编码限制性甲基化酶,hsd S:编码
5、限制性酶和甲基化酶的协同表达,1968年,Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出,Hind II和Hind III,限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶,其功能是避免外源的干扰或噬菌体的感染,是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。 根据酶的功能、大小和反应条件,及切割的特点,可以将限制性内切酶分为三类: 型酶、型酶、 型酶,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特
6、异性切割,24-26bp处,型酶: 来源:1968年,M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。 限制修饰: 同时具有内切酶和甲基化酶的活性, 蛋白结构:分子量较大,是一个三亚基双功能酶。 辅酶:Mg2+、ATP、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、 识别位点:15bp,非常特异 5-TGNNNNNNNNTGCT-3 3-ACTNNNNNNNNCGA-5 N: 任一碱基;:6-甲氨基嘌呤 酶切位点:识别位点上游约1000bp处. 但没有特异的切割位点,而且切割是随机的,所以在基因工程中应用不大。,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,
7、H i n d III H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,4. 识别顺序, 识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列,EcoR I的切割位点,识别序列一般是回文序列 Eco RI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 简并识别序列 有些酶的识别序列不
8、是一个,而是多个。 在基因重组时要尽量少用这些酶,2、特点,识别位点与酶切位点高度一致,具有高度特异性。 极为稳定 辅酶:Mg+,5、酶切位点,II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或附近,产生以下4种情况。 5粘性末端;3粘性末端;平末端和非互补的粘性末端 无论DNA的来源如何,只要是使用同一种限制性内切酶,所留下的残端都是一样的。 经酶切后,5端总是保留一个磷酸根;3端总是保留一个OH,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37 ,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,P
9、stI等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37 ,限制
10、性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件:,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,0 - 150 mM,DTT,1 mM,0 - 50 mM 低盐酶,100 mM 中盐酶,150 mM 高盐酶,Volume,20 - 100 ml,T T,37 1 - 1.5 hr,1 U 核酸内切酶的酶活性:在最佳反应条件下反应 1 小时,完全,水解 1 mg 标准DNA所需的酶量,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解:,对盐浓度要求相同的酶,原则上可以同时酶
11、切,但应注意:,5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,BamHI SmaI,5 GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA5,5 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA5,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解:,对盐浓度要求不同的酶,可采取下列方法:,使用较贵的酶的盐浓度,加大便宜酶的用量,同时酶解,低盐酶先切,然后补加盐,高盐酶再切
12、,一种酶先切,然后更换缓冲液,另一种酶再切,0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4,2.5倍体积的冰冷乙醇,冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,DNA样品的纯度:,蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,加大酶的用量,1 mg DNA 用 10U 酶,加大反应总体积,延长反应时间,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,DNA样品的甲基化程度:,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位,引入甲基,受其影响的酶有Bcl I、MboI等,但BamH I、,Bgl II、Sau3A I不受
13、影响,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列,中的胞嘧啶C5位上引入甲基,受其影响的酶有EcoR II等,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,核酸内切酶的缓冲液性质:,高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等,,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性,即,所谓的Star activity现象,EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列,但在甘,油浓度超过5%(v/v)时,也可切割5PuPuATPyPy3或者,5AATT3,大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75Ku的多肽
14、链。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子,和DNA聚合酶的分子数相近,这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶催化聚合,填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用,连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。 噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链,分子量为60Ku,其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。 另外,NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催
15、化速率,而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶,还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。,DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5
16、G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,OH,P,nick,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,连接多个平头双链DNA分子:,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接酶的反应条件,Tris-HCl,50 - 100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5 - 1 mM,DTT,5
17、mM,Volume,10 - 20 ml,T T,4 - 15 4 - 16 hr,1 U DNA连接酶的酶活性:在最佳反应条件下15 反应 1 小时,,完全连接 1 mg l-DNA(Hind III片段)所需的酶量,DNA连接酶,平头双链DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲,由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接,而平头末端的连接则属于分子间的连接,因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括:,加大连接酶用量(10倍大于粘性末端的连接),加大平头末端底物的浓度,增加分子间碰撞机会,加入10% PEG8000,促进大分子之间的有效作用,加入单价阳离子(N
18、aCl),最终浓度150-200 mM,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I( DNA pol I ,全酶),53的DNA聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质:,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-OH,5 ppp dN Mg2+,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNA pol I,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I( DNA pol I ),缺口前移标记法,大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途:,5 G-C-
19、T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+ 5 dNTP 5 ppp dA(a-32P-dATP),5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Nick translation,制备32P标记的探针,DNase I,DNA pol I,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段( Klenow ),Klenow酶的基本性质:,大肠杆菌DN
20、A聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端,三分之二的大肽段,即为Klenow酶,Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核,核酸外切酶活性,但失去了53的核酸外切酶活性,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段( Klenow ),Klenow酶的基本用途:,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,DNA片段的同位素末端标记,cDNA第二链的合成,双脱氧末端终止法测定DNA序列,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段( Klenow ),Klenow酶的基本用途:补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A
21、-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,dATP dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段( Klenow ),Klenow酶的基本用途: DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,a-32P-pppdA dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-
22、A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶,T4-DNA酶的基本特性: 在模板及引物存在的条件下,T4 DNA聚合酶催化沿53方向DNA的合成。本酶还具有35外切核酸酶的活性,该活性比DNA聚合酶I强。T4 DNA聚合酶不像大肠杆菌DNA 聚合酶 I,不具有53 外切核酸酶的活性。,在无dNTP时,可以从任何3-OH端外切,在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸暴露时停止,在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,应用:,3突出末端平滑化(
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