第二章基因工程的理论基础与基本技术.ppt
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1、第二节基因工程的基本技术,1、有毒试剂,基因工程实验安全,溴化乙锭(EB):,DEPC(焦碳酸二乙酯):强有力的蛋白质变性剂,丙烯酰胺:有毒,影响中枢神经系统,过硫酸酸铵:对粘膜和上呼吸道、眼睛和皮肤有较大危害性,吸入可致命。,2、紫外线 紫外分析仪 紫外灭菌,3、放射线 放射性同位素,氯化铯:(重金属)可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。,甲醛:毒性较大且易挥发,也是一种致癌剂,酚、氯仿:蛋白质变性剂,4、转基因生物,5、水电安全,需注意防止污染,1、微生物污染,2、DNA、RNA污染,3、其他污染,仪器的正确操作,微量移液器,离心机,灭菌锅,蒸馏水器,电子天平,由于提取DNA的目的、种类、
2、所用的生物、组织材料、实验条件等不同,DNA的提纯有很多方法。,一 DNA的提取与纯化,(一)、质粒DNA的提取,plasmid DNA,The genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell.,Genomic DNA,闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离,复性快;,(1)原理,1 .碱抽提法提取质粒DNA,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变
3、性后双链分离,难以复性而形成缠绕的结构,与蛋白质SDS复合物结合在一起,在离心的时候沉淀下去。,变性,(2) 所用的试剂作用, 溶菌酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖苷键。 在碱性条件(pH8)下有活性。, 葡萄糖,增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械力(震荡)的作用而降解。,EDTA,Mg2+、Ca 2+的螯合剂,可抑制DNA酶的活性,防止DNA被酶降解。,NaOH-SDS,NaOH:强碱,提供pH12的碱性条件,使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白,并结合成“蛋白SDS”复合物,使蛋白质(包括DNA酶)变性沉淀。,冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到
4、4.8。 用来中和NaOH变性液,使DNA复性。,高浓度的NaAc有利于变性的大分子(蛋白质、DNA、RNA等)沉淀。,用于沉淀DNA。, 乙醇,DNA用于沉淀DNA分子以水合状态“溶于”水里,乙醇能夺去DNA分子的水环境。, NaAc-HAc缓冲液, RNase A,降解RNA。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。, TE缓冲液,DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。,Tris-HCl不含金属离子(不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业),有利于以后操作; EDTA抑制DNA酶,防止DNA被酶降解。,蛋白变性剂,进一步抽提DNA溶液中的蛋白质,使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液
5、中。 (现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。, 酚-氯仿,选用,以上试剂有商业试剂盒;也可以自己配制。,(3)碱抽提法提取质粒DNA的步骤,Solution I 的配制:,使用“溶液”溶解细菌细胞壁。,第一步:溶菌,50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH8.0), 10mM EDTA, 4-5mg/ml溶菌酶, RNase A,溶液II 破坏细胞膜,蛋白质和DNA变性。,第二步:破膜,蛋白质和DNA变性,Solution II 的配制:,第三步:中和,溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。,Solution III的配制:,0.2N NaO
6、H,1.0%SDS,3M 醋酸钠(用冰醋酸调pH至4.8),最重要的是:,2. 影响质粒DNA产量的因素,菌株的遗传背景, 质粒自身的拷贝数。,一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。,(1)受体菌株,endA基因编码核酸内切酶,在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。,这是直接决定DNA产量的重要因素之一。,(3)质粒大小,分子量大的质粒,拷贝数少。,(2)质粒拷贝数,质粒本身的性质所决定。,若干常用质粒的理论产量,(二)、基因组或其他DNA的提取,1.细菌基因组DNA的制备,大肠杆菌基因组DNA,一般过程及原理:,(1)细
7、胞裂解,10%SDS和蛋白酶K。37 温育。,不用NaOH !,(3)沉淀DNA,0.6倍体积的异丙醇。,(2)DNA纯化,CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖,酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。,苯酚 2次,酚氯仿异戊醇 25 24 1 1次,氯仿异戊醇 24 1 1次,一般过程及原理:,动物组织剪成小块,置液氮中冻结后研磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。,(1)组织粉碎,2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提,0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 温育。,(2)细胞裂解,(3)纯化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。,SDS是离子型去垢剂(detergent
8、),可以使细胞膜崩解。也是蛋白质变性剂。,苯酚 2次,酚氯仿异戊醇 25 24 1 1次,氯仿异戊醇 24 1 1次,(5)除去RNA污染,用RNase。,用2倍体积的无水乙醇。,(4)沉淀DNA,(可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀),一般过程及原理:,(1)组织粉碎,用液氮冷冻后研磨成细粉末。,3. 从植物组织中制备 DNA,(2)细胞裂解,用2%CTAB / 2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇)。 或1% SDS和蛋白酶K。 65 温育。,CTAB即十六烷基三甲基溴化铵,是一种阳离子去污剂,在高离子强度的溶液里,CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物,只
9、是不能沉淀核酸。因此,CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌(包括E.coli的某些株)中制备纯化DNA 。 巯基乙醇作为还原剂使多酚氧化酶失活,可以防止酚类的氧化。,用0.6倍体积的异丙醇(-20 )。,(3)纯化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。,(4)沉淀DNA,(5)除去RNA污染,用RNase A。,(可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀) 。,(三)、DNA的定量和纯度测定,1. 紫外光谱法,DNA(或 RNA)在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。,用微量比色杯(10l)在紫外分光光度计直接测定。,原理:,蛋白质在280nm处有吸收峰,2
10、,浓度测定步骤,一、用无菌TE或双蒸水将待测样品稀释20倍或更高。,二、用无菌TE或双蒸水做对照,将紫外分光光度计260 nm、280nm、310nm调到零点。,三、加入DNA稀释液在260nm、280nm、310nm测定OD值。,四、计算DNA浓度,ssDNA:ssDNA=33(OD260OD310) 稀释倍数 dsDNA:dsDNA=50(OD260OD310) 稀释倍数 ssRNA: ssRNA=40(OD260OD310) 稀释倍数,衡量提取DNA 的纯度,OD260/OD280 1.8 可能有RNA污染,OD260/OD280 1.8 可能有蛋白质污染,再进行酶消化处理,酚氯仿抽提去
11、酶,溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中,紫外光照射下能发 红色荧光。,2. 琼脂糖凝胶电泳估计,原理:,与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比,就可以估计出DNA含量。,一般使用琼脂糖凝胶电泳,与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。,DNA分子量Marker有许多公司的商品,使用非常方便。如DNA的Hind酶切物等。,(四)、DNA分子量的估计,Marker,Marker,DNA ladder,28kb,2500bp,2300bp,1300bp,900bp,750bp,200bp,5000bp,20kb,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,30
12、0bp,200bp,100bp,DNA Marker,自从琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶被引进核酸研究以来,凝胶电泳已经发展成为一种分析重组DNA分子的重要技术手段,同时也被广泛地应用于DNA 的核酸内切酶消化片段的分析、分离和纯化以及蛋白质的分析和纯化等方面的工作。,二 凝胶电泳技术,1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动,速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。,(一)、电泳的基本原理,4.,如果电场强度一定(电压和电极距离)、电泳介质相同(电泳液和凝胶): 分子在电场中迁
13、移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。 形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大,移动越慢。,摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。,5.,Relaxed,supercoiled,Increasing degree of supercoiling,相同分子量的DNA:,闭合环状卷曲超螺旋迁移最快, 线性分子次之, 伸展开环状最慢。,超螺旋,线性,开环,(二 )、琼脂糖凝胶电泳,1. 琼脂糖,2. 琼脂糖凝胶,琼脂糖在水里(或电泳液)中加热到沸点后溶解,冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。,是一种线性多糖聚合物,从红色海藻产物琼脂中提取而来。,琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙
14、(密度)。,浓度高,空隙小,空隙小,分辨率高: 小分子较易通过,而大分子难通过; 空隙大,分辨率低: 大小分子几乎以同等速率通过。,3.琼脂糖凝胶的分辨力,空隙大小决定其分辨分子大小的能力。,带电颗粒在电场作用下移动的速度叫做电泳迁移率。(1)DNA分子的大小。 (2)DNA的构象。 (3)琼脂糖浓度。 (4)溴化乙锭使DNA迁移率下降15%。 (5)电压。 (6)电泳缓冲液的成分及浓度。,何为电泳迁移率?影响DNA琼脂糖凝胶电泳迁移率的因素有哪些?,优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。,(三) 、聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳:分离30050000bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳:分离11000b
15、p,(四)、凝胶染色,1. 染料,溴化乙锭。,Ethidium bromide (EB),EB是扁平分子,能插入DNA碱基之间,但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光,即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。,2. 原理,UVP全自动凝胶成像分析系统,OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统,(五)、聚丙烯酰胺凝胶银盐染色法,银盐染色法灵敏度比EB高200倍.但银染色后,DNA不宜回收。银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物,然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒,可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。,具体步骤
16、,1、固定液固定:2.5 ml 95%乙醇、2.5 ml冰醋酸定容到500ml,2、染色液染色:1克硝酸银定容至500ml,3、显色液显色:7.5克NaOH加5.4ml甲醛定容至500ml,DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素(32P或125I)标记的DNA或RNA探针。,三 核酸的分子杂交,(一)、Southern blot,用DNA(或RNA)探针检测DNA样品。,Southern blot 筛选结果,(二)、Northern blot,用DNA(或RNA)探针检测RNA样品。,(三)、 原位杂交,对应的菌斑或噬菌斑位置不变,可以直接找出阳性菌落。,需要目的基因的探针。,四
17、 基因扩增技术-PCR,(一)、基因扩增(gene amplification),指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式:,1. 环境诱发扩增,2. 基因的程序性扩增,5. PCR扩增,3. 基因组进化扩增,4. 基因工程扩增,1. 环境诱发扩增,如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。,在环境因子的诱发下,某些基因产生明显的扩增。,在发育的某个阶段,某些基因的大量扩增。,2. 基因的程序性扩增,如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。,生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加,结果相关的基因聚集成簇。,5. PCR扩增,应用聚合酶链式反应(Polymerase C
18、hain Reaction,PCR)技术,在体外特异性地扩增某个基因。,3. 基因组进化扩增,4. 基因工程扩增,载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。,(1),1. PCR的发明,(二)、PCR技术,1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。,当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决,设想未能实现。,Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术是利用酶促反应在体外指导特定DNA序列扩增的方法,以热变性的双链DNA分子为模板,利用引物和四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)为原料在DNA聚合酶的作
19、用下大量扩增了特定的DNA片段。,(2),Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。,1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR,使这一设想变成现实。,(3)Taq DNA 聚合酶,1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中。使 PCR自动循环仪成为可能。,(4)PCR 仪,1988年 Cetus公司发明自动热循环仪。,1986年 H.A. Erilish从嗜热 水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶,代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段(37 ),PCR技术才进入实用阶段。,PCR仪,2. PCR技术的原理,模板DNA变性,引物D
20、NA复性,引物DNA延伸,双链DNA在受热后,配对碱基的氢键断裂,DNA两条链分开成为单链。,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,TAGAACTTG,ACGTACGTA,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,3,3,5,5,3,TAGAACTTG,ACGTACGTA,95,(1)DNA模板变性,模板,模板(template),95,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,人工合成的单链DNA小片段,碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。,(2)DNA模板与引物复性,模板,模板,ATCTTGAAC,5,3,AC
21、GTACGTA,5,3,引物,引物,引物(primer):,40-65,DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。,(3)DNA链的延伸,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,模板,模板,ATCTTGAAC,5,ACGTACGTA,5,Taq,Taq,72,理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。,变性复性延伸。,(5)1个循环的结果,(4)新一轮循环开始,3. PCR的过程,(1)第一步 预变性(denature),94-95 下5分钟,模板DNA双链完全变性成单链。,(2)第二步 循环(circle),94 下
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