第二章天然药物化学成分提取分离鉴定方法与技术色谱法.ppt
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1、第二章,提取分离鉴定的方法与技术 色谱法,1,碳酸钙 (固定相),色素混合液,石油醚 (流动相),1906年,Tsweet 发现色谱分离现象,色谱柱,2,“像光谱中的光线一样,色素混合物的不同组分有规律地排列在碳酸钙柱上而彼此分离。” Tsweet,德国植物学报, 1906.,3,柱色谱,薄层色谱,纸色谱,高效液相色谱,色谱法(Chromatography),一、色谱法在研究天然药物有效成分中的应用: 分离混合物 精制化合物 鉴定化合物,4,二、原理: 利用混合物中各成分在固定相和移动相中吸附、分配及其亲和力的差异而达到分离。,色谱的三要素,5,三者相互关系 ?,按原理不同可分为: 吸附色谱法
2、* 分配色谱法* 离子交换色谱法 凝胶滤过色谱法(分子筛滤过色谱) 大孔吸附树脂法 高效液相色谱法(自学) 气相色谱法(自学),6,三、分类:,吸附色谱法 * (Adsorption Chromatography ),1)原理: 利用吸附剂对混合物中各成分分子吸附能力的差异而达到分离的色谱法。,2)分类: 物理吸附 化学吸附 半化学吸附,7,8,物理吸附*: 化学吸附: 半化学吸附:,“相似者易吸附”,避免,氢键形成能力,分子间力,无选择性,可逆。 硅胶、氧化铝、活性炭,化学键,选择性较强,常不可逆。 硅胶-生物碱 碱性氧化铝-黄酮、蒽醌等,氢键,选择性较弱,多可逆。 聚酰胺,3)吸附色谱的三
3、要素,9,溶 解 能 力,吸附作用,在液-固吸附色谱中,溶质的保留和分离选择性决定于下列三个因素:,10,11,硅 胶:适用于中性和酸性成分,氧化铝:适用于中性和碱性成分,活性炭:非极性吸附剂,聚酰胺:高分子聚合物,氢键吸附,a、吸附剂(固定相),12,硅胶(silica) SiO2 XH2O,酸性、亲水性吸附剂。,结构:内部-硅氧交联结构多孔结构范德华力 表面-有硅醇基氢键吸附,适用于中性或酸性亲脂性成分的分离。,13,特性: 1)极性吸附剂,“相似者易吸附” 物质极性,吸附能力 2)吸水失活 105110OC烘干30分钟(可逆失水)吸附力最大 500OC烘干(不可逆失水)活性丧失,无吸附力
4、,注意:活化温度不宜高,不宜分离碱性物质。,氧化铝(aluminium oxide),极性吸附剂,最适于分离植物中的碱性或中性的亲脂性成分。 有酸性、碱性和中性三种规格。 吸附特性与硅胶类似,但碱性氧化铝不宜分离酸性物质。,14,聚酰胺(polyamide) 结构:-CH2-CO-NH-n 原理:氢键吸附学说,15,酰氨基与化合物(羟基、羧基及醌基)形成氢键吸附。,16,用途: 分离黄酮类、酚类、醌类、有机酸类及鞣质。,影响吸附强弱的因素: 1、流动相:水甲醇或乙醇丙酮氯仿稀氨水甲酰胺; 2、分子结构:a、形成氢键数目多,吸附能力强。b、形成分子内氢键,吸附力减弱。C、芳香化合物中,共轭双键多
5、,吸附牢。,化合物结构对聚酰胺吸附作用的影响,形成氢键的数目,成键基团位置,双键的数目,分子内氢键,17,课本第33页,活性炭(activated carbon),非极性吸附剂,对非极性物质具有较强的亲和力,在水中对溶质表现出强的吸附能力。 从活性炭上洗脱被吸附的物质时,溶剂的极性越小,洗脱能力越强。,18,特别适合水溶性物质的分离。,b、溶 剂 (移动相),遵循“相似相溶”及“相似者易吸附”原理: 极性吸附剂,溶剂的介电常数愈大,洗脱能力愈强; 非极性吸附剂,溶剂的介电常数愈大,洗脱能力愈弱。,c、被分离物质,遵循“相似相溶”及“相似者易吸附”原理: 对于极性吸附剂而言: 被分离成分极性大,
6、吸附牢,难以洗脱; 被分离成分极性小,吸附力弱,容易洗脱。,19,四、操作方式,1、薄层色谱法(TLC)* 定义:将吸附剂均匀的铺在平板上,把要分离分析的样品点加到薄层色谱板上,然后用适当的溶剂系统展开,在一定的条件下显色或直接在日光或紫外光下观察所获得的斑点,从而达到分离、分析、鉴定的目的。,20,1)薄层色谱的吸附剂和支持剂:,在选用吸附剂或支持剂时,一般是根据被分离物质的化学性质来选用。当不了解被分离物质的化学性质时,可以先选用最常用的硅胶或氧化铝,如果分离效果不好,可再改用其他的吸附剂或支持剂。,21,常用的硅胶吸附剂,粒径:200-300目 种类:硅胶G硅胶+粘合剂煅石膏 硅胶GF2
7、54含有荧光物质 硅胶H 不含粘合剂煅石膏 硅胶HF254 含有荧光物质,22,常用的展开剂,正己烷、环己烷 、四氯化碳、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水,23,理想的溶剂应能使混合物分离后各组分的Rf值相差尽可能大,且尽量在0.2-0.8之间。,当单一溶剂不能很好地展开各组分时,常选择用混合溶剂作为展开剂。,2)薄层色谱的一般操作,a、制板 b、活化 c、点样 d、展开 e、显色 f、计算比移值,24,操作技术手工铺板,取一份吸附剂和三份水(或另加黏合剂),在研钵中向一个方向研磨混合成均匀糊状(无气泡和结块),均匀涂布在薄层板上。,玻璃板,层析专用玻璃板,清洗干净,用量,1
8、020cm,3g硅胶,黏合剂,0.30.8% CMC-Na溶液,,干燥,水平台面,室温下自然完全晾干,检查,表面光滑平整,均匀,无杂质,操 作 要 点,25,涂布后的薄层先在室温下阴干,至完全干透后,在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化,然后置干燥器中备用。 硅胶 105-110 30-60min 氧化铝 105-110 30min,26,操作技术点样,定量微升毛细管,薄层点样毛细管,配制样品的溶剂具高度挥发性和尽可能非极性,否则易使斑点扩展。 采用多次点加法,第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。 点样量应适中,过载会引起斑点拖尾,分离度变差。,(15ul),27,点样示意图,样品
9、溶液的配制,点样,28,C、展开,薄层色谱的展开方式有上行、下行、单向、双向、多次、径向等多种方式。 多数采用直线形上行展开,薄层板水平角度以75 为最佳。,29,展开剂要接触到吸附剂下沿,但切勿接触到样点(0.5cm左右高度)。 盖上盖子,展开。 观察展开情况。 取出薄层板,30,预防 边缘效应,操作技术显色,显色喷雾瓶,三用紫外灯,观察方法:日光、荧光、显色。,31,本身带有荧光,荧光斑点,32,定义:样品经色谱分离后,某成分从原点至该成分斑点中心的距离与从原点至展开剂前沿的距离的比值称为该成分的比移值(Rf值)。 原点至色谱斑点中心的距离 比移值(Rf值) 原点至展开剂前沿的距离,33,
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