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1、DNA为双链分子 大多是链状结构,少部分呈环状 分子量一般都很大 真核细胞中集中在细胞核(98%以上) 种间细胞核中DNA含量有差异 线粒体、叶绿体含各自DNA,第三节 DNA的结构,一、 DNA的一级结构 DNA分子上核苷酸的排列顺序 浏览书上关于基因(组)的概念,1. DNA的碱基组成: 具有生物种的特异性: 不同物种DNA有其独特的碱基组成; 同一物种不同组织/器官/DNA碱基组成一样, 不受生长发育、营养状况及环境条件的影响。,(二)DNA的二级结构(高级结构),(一)DNA的二级结构,1953年,J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基础上,根据DNA结晶的X-衍射图
2、谱和分子模型,提出了著名的DNA双螺旋结构模型,并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。,1.DNA碱基互补原则,DNA的二级结构(双螺旋),其他组合易相互排斥 例 如 G:T,因 此 , DNA 的 双 股 系 藉 着 A:T 和 G : C的 配 对 关 系 互 相 结 合 。,2. Chargaff定则/碱基等比定律: 嘌呤总数等于嘧啶总数 A+G=C+T; 6位上含氨基的碱基= 6位上含羰基的碱基; A+C=G+T 腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相同 A=T, 胞嘧啶和鸟嘌呤的摩尔数相同 C=G DNA分子的碱基组成具有种属特异性,而不具有组织器官特异性,3.二级结构B型双螺旋结构,大
3、部 分 DNA 所 具 有 的 双 螺 旋 结 构 , 亦 称 为 B 型,1.反向,平行,右手螺旋, 大沟,小沟,2.链间碱基配对相连 3.每10个碱基对上升一周 4.疏水碱基位于内部 5.相邻碱基平面互相平行, 垂直于螺旋轴,DNA,双螺旋,正反向,互补链。 A对T,GC连,配对时,靠氢键, AT2,GC3,十碱基,转一圈,螺距34点中间。 碱基力和氢键,维持螺旋结构坚。 (AT2,GC3是指之间二个氢键GC间三个.螺距34点中间即3.4),在 真 / 原 核 细 胞 皆 有 证 据 显 示 短 的 Z 型 DNA 存 在 。,其他类型的DNA双螺旋,Z 型 DNA左旋、细长,双螺旋结构的
4、稳定因素,提问:起稳定作用的有哪些力呢?,答案:疏水作用力(碱基堆积力) 氢键 范德华力,(二)RNA的二级结构特点,RNA是单链分子,因此,在RNA分子中,并不遵守碱基种类的数量比例关系,即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。 RNA分子中,部分区域也能形成双螺旋结构,不能形成双螺旋的部分,则形成突环。这种结构可以形象地称为“发夹型”结构。,在RNA的双螺旋结构中,碱基的配对情况不象DNA中严格。G 除了可以和C 配对外,也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA, 其二级结构有明显的差异。 tRNA中除了常见的碱基外,还存在一些稀有碱基,这类碱基大部分位于突环
5、部分.(含有稀有碱基最多的RNA就是tRNA),RNA中的碱基配对原则 A-U G-C,二级结构:含短的不完全螺旋区的多核苷酸链;,G-U 配对形成的氢键较弱,tRNA的二级结构,四臂四环结构: 氨基酸接受区、 反密码区、 二氢尿嘧啶区、 TC区和可变区。 除氨基酸接受区每个区均含有一个突环和一个臂。,(1)氨基酸接受区 包含有tRNA的3-末端和5-末端, 3-末端的最后3个核苷酸残基都是CCA,A为核苷。氨基酸可与其成酯,该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。 (2)反密码区 与氨基酸接受区相对的一般含有7个核苷酸残基的区域,其中正中的3个核苷酸残基称为反密码,(3)二氢尿嘧啶区 该区含有
6、二氢尿嘧啶。 (4) TC区 该区与二氢尿嘧啶区相对, 假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷环(TC)由7个核苷酸组成,通过由5对碱基组成的双螺旋区(TC臂)与tRNA的其余部分相连。除个别例外,几乎所有tRNA在此环中都含有TC 。 (5)可变区 位于反密码区与TC区之间,不同的tRNA该区变化较大。,三、 DNA的三级结构,(一)真核细胞染色体的DNA念珠状三级结构,DNA的存在形式,提问:DNA形成三级结构及染色体的意义何在?,答案:压缩分子空间,人体每个体细胞DNA长2m,细胞直径0.1mm,细胞核0.05mm,(二)原核生物以及真核生物细胞器环状DNA的超螺旋三级结构,负超螺旋 (右手拓扑结
7、构),反之,则为正超螺旋 自然界通常为负超螺旋。,第四节 核酸及核苷酸的性质,一、核酸的溶解性 RNA和DNA 均微溶于水, 不溶于一般的有机溶剂 二、核酸的两性性质及等电点 核酸分子中含有酸性基团(磷酸基)和碱性基团(氨基),也具有两性性质。 DNA等电点为44.5; RNA等电点为22.5,三、核酸的紫外吸收性质,碱基含有共轭双键 独特的紫外吸收光谱:最大吸收峰260nm左右 核酸及其组份定性和定量测定的依据。,四、核酸的变性、复性 1、变性(denaturation) (1)变性的实质 某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力, 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 不涉及磷
8、酸二酯键断裂,一级结构不变,降解:核苷酸骨架上3,5 -磷酸二酯键的断裂,(2)变性因素 高温(一般75) 热变性 强酸、碱 酸碱变性 强氧化剂 尿素(PAGE中DNA ) 机理:双链间氢键断开,成为两条单链,(3)增色效应,完全变性后核酸紫外吸收值增加: 天然DNA 2540%、RNA 约1.1% 这种由于变性或降解引起紫外吸收 增加的现象称为增色效应. 实质:碱基暴露,RNA变性:从螺旋到线团之间的转变 RNA的变性引起的性质变化没有DNA明显,DNA变性,(4)DNA热变性的特征,变性过程是“跃变式”的,而非渐变,是一种协同的过程。,Tm,引起DNA变性的温度称为熔点Tm 指增色效应达5
9、0%时的温度 DNA变性一半所需的温度 一般DNA Tm 值在85 - 90 C之间。,Tm值大小与下列因素有关: (1)DNA的均一性:越均一Tm的范围愈小 (2)GC含量:越多Tm越高 经验公式: XG+C(Tm69.3)2.44 (3)介质中的离子强度:愈高Tm愈高 不易用稀电解质保存DNA,核酸的复性(renaturation),变性DNA在适当的条件下,两条彼此分开的单链重新缔合成双链复性。 复性的程度、速率与复性条件有关: 热变性DNA骤然冷却(淬火)不能复性 将变性DNA缓慢冷却(退火)可以复性,DNA复性,分子量越大复性越难; 浓度越大,复性越容易; DNA复性也与它本身组成和
10、结构有关 (有很多重复序列DNA,复性也快)。 减色效应(低色效应) ,复性时紫外吸收减少,用Cot1/2表示复性的速度 Co:代表DNA的原始浓度 t:复性时间 Cot1/2复性一半所需时间与DNA浓度的乘积 单位:mol s/L,提问:为什么核酸有紫外吸光性? 答案:碱基含有共轭双键,最大吸收波长260nm 提问:什么是DNA的变性? 答案:DNA双螺旋二级结构的破坏 提问:变性因素有哪些? 变性因素:高温(一般75)、强氧化剂、 强酸、碱、尿素等; 变性机理是什么? 机理:双链间氢键断开,成为两条单链;,提问:什么是核酸的复性? 答案:一定条件下,去除变性因素后,核酸恢复二级结构及生物活
11、性的现象。,五、核酸的降解,化学降解(酸/碱水解)和酶解 作用于磷酸二酯键和糖苷键 DNA/RNA对酸/碱耐受程度有差别,1、碱水解 0.3 M NaOH溶液中: RNA磷酸酯键被水解生成2/3 -核苷酸 DNA则不受影响 无2OH不形成碱水解中间产物,2、酸水解 糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解; 嘌呤碱比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定; 对酸最不稳定的:嘌呤与脱氧核糖间糖苷键 DNA在pH2.8、100加热1h,可除去嘌呤碱 形成无嘌呤酸(apurinic acid,APA),3、酶水解,酶分类 根据底物分为: Dnase、RNase 根据作用方式: 核酸外切酶:从一端(3/5)逐个水解 核酸内切
12、酶:从中间开始在某个位点切断,按照作用的化学键 磷酸二酯酶(phosphodiesterase) 断3-OH形成的酯键 5-磷酸核苷 断5-OH形成的酯键 3-磷酸核苷 磷酸单酯酶(phosphomonoesterase) 切去核酸分子末端磷酸基 及核苷酸的磷酸基,其它:对底物二级结构的专一性 作用于双链核酸:双链酶 作用于单链:单链酶,+,+,Py,Py,Py,Py,Py,Py,Pu,Pu,P,P,P,P,P,P,P,P,P,P,2H2O,P,P,P,P,P,P,P,2H2O,P,P,+,+,OH,OH,P,P,P,P,P,G,A,G,A,A,A,G,G,C,U,U,C,牛胰核糖核酸酶(RN
13、ase ) 作用:嘧啶核苷3磷酸与其它核苷酸连键 专一性极高的内切酶,(1)RNase,3嘧啶核苷酸/其结尾的寡核苷酸,+,+,Py,Py,Py,Py,Py,Py,Pu,Pu,P,P,P,P,P,P,P,P,P,P,2H2O,P,P,P,P,P,P,P,2H2O,P,P,+,+,OH,OH,P,P,P,P,P,G,A,G,A,A,A,G,G,C,U,U,C,核糖核酸酶T1 (RNase T1) 作用:3鸟苷酸与相邻核苷酸5OH连键 产物:3鸟苷酸或以其为末端的寡核苷酸,核糖核酸酶T2 (RNase T2 ) 作用位点为腺苷酸残基 可将tRNA完全降解为3腺苷酸结尾的寡核苷酸,(2)DNase(
14、外切酶) DNase:牛胰脱氧核糖核酸酶 Mg2+激活 切断双链或单链DNA 以5磷酸为末端的寡聚核苷酸, DNase :牛脾脱氧核糖核酸酶 Mg2+抑制 DNA降解为3磷酸为末端的寡聚核苷酸,(3)其他核酸外切酶 牛脾磷酸二酯酶 蛇毒磷酸二酯酶 对DNA/RNA均有作用,六、DNA一级结构的测定,1、末端终止法Sanger 2,3双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)是 DNA合成链延伸的抑制剂,2、化学法 硫酸二甲酯:G断裂 甲酸:A、G均断裂 肼:无NaCl时C、T均断裂 有NaCl时仅C断裂,使甲基化,第六节 核酸分析测定及研究方法,一、核酸及其组分含量的测定 1、紫外吸收法 核酸及其组分对紫
15、外线的吸光率与其浓度成正比 1个A50g/ml 双螺旋DNA 40g/ml RNA或单链DNA 2、定糖法 RNA:核糖 糠醛 绿色物质(670-680nm) DNA:脱氧核糖+二苯胺兰色物质 (595-620nm),苔黑酚/地衣酚,浓HCl,浓硫酸,3、定磷法 核酸纯的核酸含磷量为9.5% 核酸样品含1g磷相当于10.5g核酸 (实验课) 4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比,通过与分子标签比较就可得出待测DNA分子的大小和含量。,二、核酸纯度的测定 通常用A260/A280 =1.8-2.0作为纯度标准
16、纯DNA比值1.8, 1.8 Pr污染, 1.8 RNA污染 纯RNA比值2.0 , 2.0 Pr污染, 2.0异硫氰酸污染。,三、常用分子生物学技术 1、凝胶电泳 琼脂糖、PAGE 不同构象的DNA分子迁移率不同 超螺旋线状分子开环状分子 2、核酸分子杂交 3、印迹技术 4、PCR技术:变性、退火与延伸,核酸的杂交,热变性的DNA单链,在复性时 与同源DNA互补链形成双螺旋结构; 与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。 这样形成的新分子称为杂交DNA分子 DNA单链与互补RNA链间也可发生杂交,1.核酸的多核苷酸之间的连接方式是 A. 2, 3磷酸二酯键 B. 3,5磷酸二酯
17、键 C. 2 ,5磷酸二酯键 D. 糖苷键 E. 氢键 2. DNA合成需要的原料是 A. ATP,CTP,GTP,TTP B. ATP,CTP,GTP,UTP C dATP,dCTP,dGTP,dTTP D dATP,dCTP,dGTP,dUTP E dAMP,dCMP,dGMP,dTMP 3. 关于Watson and Crick 的DNA双螺旋模型,那种说法是错误的 A. 组成双螺旋的两条DNA 链反向平行 B. 碱基对位于双螺旋的内侧 C. 维系双螺旋结构的作用力主要是碱基堆积力 D. DNA 双链是左手螺旋,B, C,D,4. DNA和RNA共有的成分是 A. D 核糖 B. D 2
18、-脱氧核糖 C. 鸟嘌呤 D. 尿嘧啶 E. 胸腺嘧啶 5. DNA和RNA彻底水解后的产物是 A. 戊糖相同,部分碱基不同 B. 碱基相同,戊糖不同 C. 戊糖相同,碱基不同 D. 部分碱基不同,戊糖不同 E. 碱基相同,部分戊糖不同 6. 核酸具有紫外吸收能力的原因是 A. 嘌呤和嘧啶环中有共轭双键 B. 嘌呤和嘧啶中有酮基 C. 嘌呤和嘧啶中有氨基 D. 嘌呤和嘧啶连接了核糖 E. 嘌呤和嘧啶连接了磷酸基团,C,D,A,7. 组成核酸的基本单位是 A. 嘌呤碱与嘧啶碱 B. 核糖与脱氧核糖 C. 核苷 D. 核苷 酸 E. 寡核苷 酸 8. 在核酸结构中含量较稳定的元素是 A. C B.
19、 H C. O D. N E. P 9. tRNA的二级结构为 A. 双螺旋 B. 超螺旋 C. 线形 D. 三叶草形 E. 倒“L”形 10. 碱基互补配对形成的键是 维持碱基对之间堆积力的是 核苷酸之间的连接键是 核酸分子中紫外吸收较强的键- 不利于维持双螺旋稳定的力是 A. 氢键 B. 磷酸二酯键 C. 范德华力 D. 碱基中的共轭双键 E. 静电斥力,D,P,D, A C B D E,11. 假尿嘧啶核苷酸的糖苷键是 A. C-C 键 B. C-N 键 C. N - N键 D. C-H 键 E. N-H 键 12. 下列各DNA分子中,碱基组成比例各不相同,其中那种DNA的Tm最低 A. A-T占15% B. G-C占25% C. G-C占40% D. A-T占80% E. G-C占35% 13. DNA变性时,其理化性质发生的改变主要是 A. 溶液黏度升高 B. 浮力密度下降 C. 260nm处光吸收增强 D. 易被蛋白酶降解 E. 分子量降低 14. 名词解释 增色/减色效应 核苷酸 DNA变性/复性 Tm 核酸分子杂交,A,D,C,
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