第二章蛋白质的检测和分离.ppt
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1、第三章 蛋白质的分离 提纯及检测,第一节 引言 第二节 前处理 第三节 蛋白质的粗分离 第四节 蛋白质的层析分离 第五节 蛋白质的电泳分离 第六节 蛋白质的结晶 第七节 蛋白质的检测,第一节 引言,一、蛋白质的存在 蛋白质存在于所有的生物细胞中,是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 一般蛋白质,酶、抗体、激素蛋白、毒素蛋白等 存在部位 器官、组织、体液 胞内、胞外,一、蛋白质的存在,存在形式 游离状态 消化液中的蛋白 结合状态 蛋白与蛋白 蛋白与非蛋白,二、为什么要分离提纯蛋白质?,1、农业生产的需要 (1)对农副产品的综合利用需要高活性的酶制剂。 (2)用酶分析法测定家畜家禽以及农作物中
2、某种物质的含量,需要用高纯度的酶制剂。,二、为什么要分离提纯蛋白质?,2、工业生产的需要 食品、发酵、纺织、制革等工业,需要大量的高活性的酶制剂。 淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、葡萄糖异构酶,二、为什么要分离提纯蛋白质?,3、医疗上的需要 人尿激酶治疗脑血栓 用猪心细胞色素C治疗脑震荡心力衰竭 用猪胰岛素治疗糖尿病,二、为什么要分离提纯蛋白质?,4、蛋白质结构与功能研究及基因工程研究的需要 均一的蛋白制剂 工具酶 高纯度的标准蛋白,三、对蛋白质分离提纯的要求,1、纯度 决定于研究的目的和应用上的要求 2、活性 要求蛋白质保持天然构象状态,有高度的生物活性 3、收率 收率越高越好
3、 提纯步骤愈多,则损失愈大 作为均一制剂,一般收率在5-20,最高可以达到50左右。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,准备工作: 1、选材,处理; 2、建立适当的细胞破碎和蛋白质抽提方法; 3、建立一系列的分离提纯和浓缩的方法; 4、建立灵敏而方便的分析方法,以估计每一个分离提纯步骤的提纯倍数和收率; 5、建立鉴定纯度的方法(如:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等),以鉴定蛋白质制剂的纯度。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,蛋白质分离提纯的四个阶段: 第一阶段(前处理): 选材,破碎,抽提,离心分离,得无细胞抽提液。胞外蛋白不须细胞破碎。 第二阶段(粗分级): 根据不同蛋白质的溶解度差异,采用适
4、当的沉淀法,对所需蛋白质进行初步的分离提纯。 如:盐析法、等电点法、有机溶剂沉淀法、选择性变性法,以及选择性沉淀法等。 适合于处理大量的样品溶液。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,第三阶段(细分级): 经过粗分离得到的蛋白质制剂是不纯的 细分级可以采用适当的柱层析法。 如:离子交换柱层析(DEAE-纤维素、CM-纤维素)、分子筛层析(Sephadex)、吸附层析(羟基磷灰石)、疏水吸附层析、亲和层析、抗原抗体法等。 柱层析法对蛋白质的分离提纯效果很好,但不能处理大量的样品溶液 制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳,或蔗糖密度梯度等电聚焦法进一步提纯。 此二法只能处理少量样品,所以在提纯的后期使用,比较合适。
5、 采用结晶法对蛋白质进一步提纯。 蛋白质制剂必须达到较高纯度才能进行结晶。所以,结晶法是在提纯的后期使用的。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,第四阶段(质量鉴定):纯度、浓度 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦法、超离心沉降法、免疫电泳法、酶活力法、蛋白质化学结构分析法等。 一般需要用两种或更多的方法鉴定蛋白质制剂的纯度。 经常使用Folin-酚法,双缩脲法、紫外吸收法考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度。 酶需要测定比活力及酶溶液的蛋白质浓度。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,防止蛋白质变性的措施: 1、低温(0一4)操作,防止热变性和蛋白水解酶水解。 2、严格控制pH值,防止过酸过碱对蛋白质的变性
6、作用。 3、搅拌要缓慢,防止泡沫表面张力引起蛋白质变性。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,防止蛋白质变性的措施: 4、防止蛋白质自发变性,可以采取下列措施: (1)加入低分子量物质(如蔗糖和甘油等)或加入纯化的蛋白质(如牛血清白蛋白、明胶等),以提高蛋白质浓度,减少水的伤害。 (2)少数蛋白质必须在高离子强度的极性介质中才能保持活性,可以加KCI,或NaCl,(NH4)2SO4。 (3)有的蛋白质需要加入二价金属离子(如Mg2+、Ca2+等)才能保持稳定性。 (4)某些酶的提纯和保存,需要加入底物,才能稳定。,四、蛋白质分离提纯的一般程序,需要额外注意的两个问题: 天然构象的保持 多亚基多功能寡
7、聚酶,第二节 前处理,一、材料的选择 二、细胞破碎 三、抽提,第二节 前处理,一、材料的选择 选材的原则是: (1)材料中所需蛋白质的含量要高; (2)材料易得。,一、材料的选择,材料中蛋白质含量的多少与下列因素有关: 种属差异,如人与牛的同一种蛋白质,其含量常常相差十倍之多; 个体差异,在不同个体中,蛋白质含量也有明显的不同; 由于性别、年龄、季节、饲料条件的不同,蛋白质的含量也会发生变化。,一、材料的选择,从实验动物体内取材时,要注意三点: (1)要注意动物本身的生理特征; (2)要尽可能在接近正常状态下取出器官或组织; (3)死后的变化要限制在最小限度内,为此必须迅速取出器官或组织,充分
8、脱血,立即使用,或放在-10-50的冷库中冻存。,二、细胞破碎,根据实验材料的性质,选择破碎方法 肝、脑、肾、脾等软组织,容易破碎,可以用匀浆器研磨; 肌肉不易破碎,可以先用绞肉机绞碎,然后用组织捣碎机粉碎; 红血球,其细胞膜脆弱,可以用低渗透压法破碎。 植物细胞,韦林氏捣切器、压榨机、石英砂研磨。 酵母和细菌细胞,可用法兰西压榨机(Frenchpress)、MantonGaulin匀浆器、振动研磨机、超声波破碎、反复冻融法。 化学法(去垢剂)、生物学方法(溶菌酶)。,二、细胞破碎,检查细胞的破碎程度的方法: (1)显微镜观察; (2)用分度管检查 将破碎细胞的悬浮液装于分度管中,离心3分钟,
9、未碎的完整细胞首先沉降,在它上面是细胞碎片,再上面是细胞质部分。每一层的相对含量即表示细胞破碎程度。,三、抽提,抽提就是将破碎细胞中的蛋白质溶解在适当的溶剂中。 根据所需蛋白质溶解性,采用适当的溶剂抽提。 水溶性的清蛋白(如:血清白蛋白、卵清蛋白等)可以用水抽提; 不溶于水的盐溶性球蛋白(如:血红蛋白、肌红蛋白等)可以用稀中性盐溶液(如0.1MNaCl)抽提;,三、抽提,不溶于水和盐溶液但可溶于稀碱溶液的米谷蛋白和麦谷蛋白,可以用稀碱溶液抽提; 不溶于水和中性盐溶液,但能溶于7080乙醇溶液中的醇溶蛋白(如醇溶谷蛋白),可以用7080乙醇溶液抽提; 脂蛋白要用表面活性剂(即洗涤剂)才能抽提出来
10、, 膜蛋白往往用非离子型表面活性剂的稀溶液抽提。 不溶性蛋白,如角蛋白、胶原、丝心蛋白,可以用适当的溶剂洗去可溶物。,三、抽提,使用类似于生理条件下的缓冲液 2050mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.07.5) 0.1mol/L Tris-HCI(pH7.5) 含少量缓冲液的0.1mol/LKCl 必要时,可加入EDTA(15mmol/L),巯基乙醇(3-20mmol/L)或蛋白质稳定剂等。,三、抽提,抽提的原则是:少量多次。,三、抽提,抽提过程中需要注意: 低温(0-4)抽提; 抽提蛋白水解酶时,须加入抑制剂; 如:以Ser为活性中心的酶,加二异丙基氟磷酸(DFP),以巯基为活性中心的酶,加
11、对氯汞苯甲酸(PCMB)。 抽提含有活性巯基的蛋白质时,要保护巯基 不要带入金属离子,可加入金属螯合剂,如EDTA; 不要带进氧化剂,可加入还原剂,如抗坏血酸等;,三、抽提,抽提过程中需要注意: 抽提带非共价键结合的配基的蛋白质时,要保护配基,不要使其丢失; 选择抽提条件时应考虑,尽量减少非蛋白质杂质被同时抽提出来; 如实验材料含有大量的脂肪,为了避免它干扰以后的分离提纯操作,须用有机溶剂(如:丙酮、石油醚)萃取,以去除脂肪。,三、抽提,抽提过程中需要注意: 防止植物组织中的多酚物质,氧化褐变,干扰蛋白质的分离提纯。 对植物组织使用较高浓度的缓冲液作为抽提液,防止植物细胞的内含物改变抽提液的p
12、H值。 抽提外周膜蛋白时,必须用含有EDTA的适当缓冲液;抽提内嵌膜蛋白时,必须用去污剂作增溶剂。 可用高速离心法和过滤法(添加适当的助滤剂)使粗提液澄清。粗提液中如有大量核酸,可用核酸酶或用鱼精蛋白去除。,第三节 蛋白质的粗分离,根据蛋白质的溶解度差异分离 根据蛋白质分子大小的差异分离,盐析法,原理:是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液,使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏,导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素被去除沉淀。 优点:沉淀的蛋白质保持着它的天然构象,能再溶解。,一、根据蛋白质溶解性的差异分离,有机溶剂分级分离法,选择原则:与水完全混溶 不与蛋白质反应 有较好的沉淀效应 溶剂蒸
13、气无毒、不易燃 原理:是将有机溶剂(丙酮、乙醇)加入蛋白质溶液中,导致溶液介电常数降低,增加了相反电荷之间的吸引力,蛋白质分子表面可解离基的离子化强度减弱,水化程度降低,因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。,有机溶剂,优点:比盐析法分辨率高,提纯效果好,生产中应用多。 注意事项:使用丙酮沉淀时,必须在04下进行。丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后,应立即分离,防止变性。,3.有机聚合物沉淀法,水溶性中性高聚物 聚乙二醇(PEG) 聚丙烯酸碱性蛋白质,4.选择性变性沉淀法,极端条件 热、pH、有机溶剂 等电点沉淀 氯仿血红蛋白 免疫沉淀 抗原抗体特异结合形成不溶性复合物,透析,
14、透析(dialysis):利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法 。只用于除盐类和小分子杂质,二、根据蛋白质分子大小的差异分离,2.超过滤:应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜,达到浓缩蛋白质溶液的目的。除小分子杂质,分离、浓缩蛋白质,加压,蛋白质溶液,半透膜,超滤液,支持膜的栅板,3.密度梯度离心:蛋白质颗粒沉降不仅决定于它的大小,也决定于它的密度。若它在具有密度梯度的介质中离心时,质量和密度大的颗粒沉降的较快,每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度时,即停止不前。,第四节 蛋白质的层析分离,层析技术也称色谱法(chromatography),是1906年
15、俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开,由此得名为“色谱法”。 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 1941年,英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论。 以后层析法不断发展,相继出现气相层析、高压液相层析、纸层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。,一、层析概述 二、离子交换层析 三、凝胶过滤层析 四、疏水层析 五、亲和层析 六、吸附层析 七、聚焦层析 八、高效液相层析,(一)层析的原理,层析技术是一组相关分离方法的总称,当待分离的混合物随流动相通过固定相时,由于各组份
16、的理化性质存在差异,与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等)的能力不同,在两相中的分配(含量对比)不同,而且随流动相向前移动,各组份不断地在两相中进行再分配,从而达到将各组份分离的目的。,一、层析概述,层析分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液(流动相)经过一个固态物质(固定相)时,根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等,使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配,并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,(二)层析的分类,按固定相基质的形式: 柱层析、纸层析和薄层层析,根据流动相的形式: 液相层析、气相层析,凝胶过滤,原理,吸附层析,疏水层析,分配层析,亲和层析,离子交换,(三)
17、层析前蛋白质处理,主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法,使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开,这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白质,但分辨率低。,(四)层析基本操作过程,上样均一性 洗脱装置,目的不同 检测方法不同 活性检测,基质均匀性 柱层析的L/d比值,1、柱层析的L/d比值,2、洗脱装置,不改变溶剂体系 依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱 缺点:随着溶液的流去,水位差也逐渐减小,流速也在变小。 改善:蠕动泵或恒流泵,维持流速恒定的简易装置,改变溶剂系统,分级洗脱 在一个溶剂系统洗涤后,改用另一溶剂系统。 缺点:蛋白质和层析基质的结合
18、强度相差并不很大,溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质,达不到分离纯化的目的。,改变溶剂系统,梯度洗脱 一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中,经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液,在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。 注意:梯度洗脱呈现一个峰,但有可能存在两个性质接近的蛋白质。,线性梯度洗脱装置,性能未知样品的蛋白质分离: 改变缓慢的梯度洗脱若为单峰:分级洗脱,3、结果检测,活性检测 比活没有提高 目的蛋白与杂蛋白并没有分开 比活有所提高,但总活性回收很低 目的蛋白有损失或有失活现象 测
19、定蛋白质一级结构时,可不考虑目的蛋白的生物活性,结果保存 薄层层析&纸层析 照相保存 扫描仪转为图形 积分仪变成数据 柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理,4、层析装置的仪器化,HPLC,与微机、质谱等连用,二、离子交换层析 (ion exchange chromatography,IEX),(一)原理,离子交换层析(ion exchange chromatography,IEX) 技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相,以蛋白质等样品为移动相,分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 原理:利用蛋白质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用,进而达到分离纯化的目的。,惰性支
20、持物(高分子聚合物基质) 解离基团(配基),共价结合,平衡离子是结合于配基上的相反离子,它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。 阳离子交换剂:平衡离子带正电的离子交换剂,能与带正电的离子基团发生交换作用 阴离子交换剂:平衡离子带负电的离子交换剂,与带负电的离子基团发生交换作用,pH值的影响,离子溶度影响,离子浓度增加,离子取代顺序,(二)离子交换剂的基本类型,根据可供交换的离子性质: 阳离子交换剂 阴离子交换剂 按解离基团的解离pH值: 强酸型交换剂 强碱型交换剂 弱酸型交换剂 弱碱型交换剂,离子交换剂的基质,琼脂糖 离子交换剂,离子交换 交联葡聚糖,聚苯乙烯,离子交换 纤维素,1、离
21、子交换纤维素,常用:DEAE-纤维素(二乙基氨基纤维素) CM-纤维素(羧甲基纤维素),优点: 开放性长链和松散的网状结构,有较大的表面积,吸附容量大,通透性好,大分子可自由通过,使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多。 亲水性,对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢,用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的,因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。 回收率高,缺点: 交换剂膨胀,2、交联葡聚糖,优点:,不会引起被分离物质的变性或失活 非特异性吸附 交换容量大 同时具有分子筛效应,离子交换葡聚糖的选用:,一般根据蛋白质的分子量而定 中等分子量(30000-200000)一般选A50和C50 低分子
22、量(30000)和高分子量(200000) 均宜选用A25和C25。,3、琼脂糖离子交换剂,优点:,对pH及温度的变化均较稳定,可在pH310和070范围内使用,改变离子强度或pH时,床体积变化不大 交换剂坚硬,颗粒呈微球型,分辨率高 流速快,吸附量大 特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离,4、聚苯乙烯,阴离子交换剂 Amberlite IRA & Dowex eg. Dowex4-100 阳离子交换剂 Amberlite IRC & Dowex,强阴离子交换剂,交联度为4%,颗粒度为50-100目,5、其他,聚乙烯醇 DEAE-Toyopearl & CM-Toyopearl
23、 富羟基 高亲水性 兼性离子交换剂 基质上连有-丙氨酸、对氨基苯磺酸、精氨酸等偶极离子,(三)基本操作,1、离子交换剂的选择,配基的选择 取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷,如果带正电,则选择阳离子交换剂;如带负电,则选择阴离子交换剂。 一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。,基质的选择,颗粒大小,2、离子交换剂的处理,酸碱浸泡 进一步去除杂质,并使离子交换剂带上需要的平衡离子,一般阳离子交换剂最后用碱NaOH处理,阴离子交换剂最后用酸HCl处理。,膨化 将干粉在水中充分溶胀,以使离子交换剂颗粒的孔隙增大,具有交换活性的配基充分暴露出来。,水悬浮 去除杂质和细小颗粒
24、,3、缓冲液的选择,离子强度和pH 保证各个待分离物质的稳定;使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合,而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定; 注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子,否则会大大降低交换容量,影响分离效果。 缓冲液不能干扰洗脱液的测定。,4、层析柱的选择,亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大 增加柱长为宜,使待分离的组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加,柱的直径与高度的比以1:20左右为宜。,采用离子强度较大的梯度洗脱 选用粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附的离子时,这些被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动,如果柱细长,即
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- 第二 蛋白质 检测 分离
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