《第14章基因重组和基因工程.pps》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第14章基因重组和基因工程.pps(118页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering,第14章,DNA克隆、测序与重组技术的历史,1973年,Stanley Cohen等人首次获得体外重组DNA的分子克隆 1977年,Allan Maxam和Walter Gilbert的化学裂解DNA测序问世 不久,Sanger 等的双脱氧测序法 20世纪90年代启动人类基因组计划(human genome project,HGP) 重组DNA技术学(Recombinant DNA Technology),第一节 自然界DNA重组和基因转移是经常发生的 DNA Recombinati
2、on and Gene Transfer Occur Frequently in Nature,DNA重组,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination),又称基本重组(general recombination)。是最基本的DNA重组方式,通过链的断裂和再连接,在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,以E.coli的同源重组为例,了解同源重组机制的Holliday模型。,一、同源重组是最基本的DNA重组方式,Holliday模型的4个关键步骤:,两个同源染色体DNA排列整齐;,一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接,形成Ho
3、lliday中间体;,通过分支移动产生异源双链DNA;,Holliday中间体切开并修复,形成两个双链重组体DNA,分别为:,片段重组体 (见模型图左边产物): 切开的链与原来断裂的是同一条链,重组 体含有一段异源双链区,其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体(见模型图右边产物): 切开的链并非原来断裂的链,重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,Holiday中间体,5,片段重组体,拼接重组体,二、细菌的基因转移与重组有四种方式,(一)接合作用,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时,质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)的DNA转移称为接合作用(conjugation)。,
4、可接合质粒如 F 因子(F factor),细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。,质粒,(二)转化作用,通过自动获取或人为地供给外源DNA,使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型,称为转化作用 (transformation)。,例:溶菌时,裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,(三)转导作用,当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(供体)细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。,噬菌体的生活史,溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway),三、位点特异重组,即特异位点
5、间发生的整合,位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化,在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。,噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合;反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。,(一)噬菌体DNA的整合,(二)细菌的特异位点重组,沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。,hix为反向重复序列,它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P,其一驱动hin基因表达,另一正向时驱动H2和rH1基因表达,反向(倒位)时H
6、2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。,沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变,(三)免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig),由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成,分别由三个独立的基因族编码,其中两个编码轻链(和),一个编码重链。,轻链的基因片段:,重链的基因片段:,重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游,J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两个,
7、分别产生蛋白质RAG1和RAG2。,V,J,分子内转酯反应,单链切开 转移核苷酸 修复、连接,免疫球蛋白基因重排过程,四、转座重组,由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。,大多数基因在基因组内的位置是固定的,但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。,插入序列(insertion sequences, IS)组成:,(一)插入序列转座,二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列,特有的正向重复序列,一个转座酶(transposase)编码基因,插入序列发生转座的形式:,保守性转座(cons
8、ervative transposition),复制性转座(duplicative transposition),插入序列的复制性转座,转座子(transposons) 可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。,(二)转座子转座,转座子组成:,反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因,细菌的可流动性元件 A插入序列:转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示) B转座子Tn3:含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因 C转座子Tn10:含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L,由转座子介导的转座,第二节 重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆,DNA Reco
9、mbination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone,重组DNA技术的发展史,1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司,专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原
10、理 重组DNA技术与医学的关系,本节主要内容:,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning),即无性繁殖。,(一) DNA克隆,技术水平:分子克隆(molecular clone) (即DNA 克隆) 细胞克隆 个体克隆(动物或植物),应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子,也称
11、基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。,DNA克隆,生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,目的: 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质),基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,又称重组DNA工艺学。,基因工程的操作过程,切,接,转,增,筛,(二)工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease),限制性核
12、酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,定义:,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源DNA,保护自身DNA。,、(基因工程技术中常用型),分类:,作用:,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,DNA底物,双链DNA,双链DNA,甲基化作用,有,无,有,辅助因子,ATP Mg2+ SAM,ATP Mg2+,Mg2+,识别序列,特异,特异,特异,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特异性
13、切割,24-26bp处,双链DNA,第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写; 第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写; 第四个字母代表株; 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名:,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口 :平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,来源不同的限制酶,但能识别和切割同一位点,这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同功异源酶:,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA后,产生相同的粘性末端,称为同尾酶。这
14、两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,同尾酶,II 型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口,1、在识别顺序的双侧末端切割DNA双链,于对称轴的5, 端切割,产生5, 端突出的粘性末端 2、在识别顺序的双侧末端切割DNA双链,于对称轴的3, 端切割,产生3, 端突出的粘性末端 3、在识别顺序的对称轴上,对双链DNA同时切割,产生平末端,EcoRI等产生的5粘性末端,5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5,EcoRI 37 ,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-
15、T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,
16、3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37 ,限制性内切核酸酶,重组DNA技术中常用的工具酶,(三)目的基因(target gene):所要克隆并 进行研究的基因。,cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体
17、整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。,(四)基因载体,定义 为携带目的基因,实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA,克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准:,能自主复制; 具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选和鉴定; 有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点; 分子量小,以容纳较
18、大的外源DNA。,质粒 (plasmid),特点: 能在宿主细胞内独立自主复制;带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,噬菌体DNA改造系统 gt系列(插入型,适用cDNA克隆) EMBL系列(置换型,适用基因组克隆),噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统(含lacZ基因) M13mp系列 pUC系列,酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 (如腺病毒,腺病毒相关病毒,逆转录病毒),其他,二、重组DNA技术基
19、本原理,基本原理,以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程,(一)目的基因的获取,化学合成法 要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第22章),* 化学合成法获取目的基因,要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 一般用于小分子基因的合成,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库 存在于转化细胞
20、内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组DNA文库获取目的基因,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,从cDNA文库获取目的基因,cDNA文库(cDNA library): 以某种细胞的全部mRNA为模板,利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA(cDNA)再复制成双链cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌,得到含全部表达基因的种群,称为C-文库(cDNA library)。,C-文库具有组织细胞特异性。,如已知目的基因两端的序列,则可采用聚合酶链反应(PCR)技术,在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。,利用PCR合成:,(二)克隆载体的选
21、择和构建,目的不同,操作基因的性质不同,载体的选择和改建方法也不同。,(三)外源基因与载体的连接,方式:(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接,粘性末端连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,同一限制酶切位点连接,一.同源粘性末端的连接,目的基因与载体具有同源粘性末端,最易连接 缺点:1 载体易自身环化而产生假阳性 可用碱性磷酸酶水解载体的5-磷酸末端 2 易产生多拷贝插入 同时插入多个目的基因,表达混乱或不表达,可通过限制目的基因与载体的比例来控制目的基因:载体=510:1 3 双向插入 只扩增的无碍;要表达的则必须是正向插入,需筛
22、选出正向插入的重组子,不同限制酶切位点(非配伍末端)的连接,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2、平端连接,(一)用限制性内切酶直接切割 SmaI -CCCGGG- C.G之间切断成平末端 -GGGCCC- -CCC GGG- -GGG CCC- (二)从粘性末端改造成平末端 1 补齐法 5AATTC G3 3 G CTTAA5 用Klenow大片段 2 削平法 用核酸酶S2,在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下,在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端,再进行粘端连接。,同聚物加尾连接,由平端加上新的酶切位点,再用限制酶切除产生粘性末端,而进
23、行粘端连接。,人工接头(linker)连接,人工接头及其应用,(四)重组DNA导入宿主细胞,一 宿主细胞的分类 原核细胞:大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌等,用于复制,扩增及表达。 真核细胞:酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞,只用于表达。 二 宿主细胞的要求 易导入重组子,易扩增表达,不被修饰、切割,符合安全。,感受态细胞:受体细胞经处理后处于最适摄取和容忍重组体的状态。,导入方式: 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection),(四)重组DNA导入受体菌,转化:以质粒为载体,将重组DNA导入细菌并得到表达的过程。 转染:以噬菌体或病毒为载体将
24、外源DNA导入宿主细胞的过程。 转导:以噬菌体为媒介,将外源DNA导入细胞的过程。 致敏过程:用理化方法诱导细胞进入感受态的操作。,转化方法,化学法:00C,CaCl2致敏 电击转化法:不需致敏,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌。 收集处于对数生长期的细菌 放于预冷的00C,CaCl2 溶液中作用 加入外源DNA 420C,短暂热处理(吸收DNA) 加入培养基培养后涂板 选出转化菌落,电穿孔转化,将待转化的质粒或DNA重组体连接液加在电穿孔转化仪的样品池中,两极施加高压电场。在强大电场的作用下,细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙,质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单,而且几乎对所
25、有含细胞壁结构的受体细胞均有效,但转化效率差别很大,1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等,(五)重组体的筛选,(插入失活法) 抗药性标记选择,2)标志补救(-半乳糖苷酶系统筛选),互补,利用互补原理筛选重组体pUC18,组氨酸缺陷 型大肠杆菌,无组氨酸 的培养基,酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,菌落原位杂交法的基本操作:,影印,用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板,洗涤
26、,杂交,感光,用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜,用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜,80烘干固定影印薄膜,薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温,用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜,用X光胶片覆盖薄膜感光,原位杂交,Southern印迹,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,免疫学方法,二重组DNA的酶切分析与鉴定,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的PCR扩增片段,重组DNA技术操作过程可形象归纳为:,小结,重组DNA技术操作的主要步骤,表达体系的建立: 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化,(六)克隆基因的表达,标准:选择标志 强启动子 翻译调控序列
27、 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足: 不宜表达真核基因组DNA; 不能加工表达的真核蛋白质; 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ; 很难表达大量可溶性蛋白。,1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用),大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌,优点:可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点:操作技术难、费时、经济,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法:磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射,2.真核表达体系(酵母、昆虫、乳类动物细胞),表达载体pFASTBACI 的物理图谱
28、,表达载体YEpI PT的物理图谱,第三节 重组DNA技术与医学 的关系非常密切并前景远大,DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective,一、疾病基因的发现与克隆,根据基因定位克隆之并研究其性质,而认识疾病的分子机制。,疾病基因发现的两个典型例子:,脆性X综合征,Kallmann综合征,二、生物制药,利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业,并将有望成为21世纪的支柱产业。,美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成
29、人胰岛素并投放市场,标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止,已有50多种基因工程药物上市,近千种处于研发状态,形成一个巨大的高新技术产业,产生了不可估量的社会效益和经济效益。,重组DNA医药产品,基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理,在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。又称DNA诊断 。,三、基因诊断与治疗,(一)基因诊断的概念,基本过程:,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,能正确扩增靶基因; 能准确区分单个碱基的差别; 本底或噪声低,不干扰DNA的鉴定; 便于完全自动化操作,适合大面积、大人群普查。,标准:,(二)基因治疗的概念,定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因,以纠正或补偿其基因的缺陷,从而达到治疗的目的。,方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy),1. 产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4. 遗传病易感性,四、遗传疾病的预防,
链接地址:https://www.31doc.com/p-2975214.html