第八章遗传重组2.ppt
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1、第八章 遗传重组,Recombination,遗传物质发生变异主要有两方面原因:,突变和重组,重组染色体序列发生重排和新的组合,是遗传的灵魂!,遗传重组,遗传重组:造成基因型变化的基因交流过程。 发生:减数分裂性细胞内,体细胞 地点:核基因间,叶绿体基因间,线粒体基因间,重组子间; 前提条件:不同基因型的遗传物质彼此能够转移。 作用: 保证了遗传多样性,为选择奠定了物质基础,是生物得以进化发展,与突变一起是变异的来源,遗传重组主要类型:(依据对DNA序列和 所需蛋白质因子的要求) 同源重组 位点专一性重组 异常重组 其共同点是双股DNA间的物质交换,但发生的情况不同。,第一节 遗传重组的类型,
2、遗传重组或称基因重组是遗传的基本现象。无论高等真核生物,还是细菌、病毒都存在遗传重组现象;遗传重组不仅发生于代与代之间,即在减数分裂中发生基因重组,一个个体的基因组也可以发生重排,即在体细胞中也会发生重组,这能产生基因表达的改变,在一个个体的细胞之间产生遗传基因的多样性;另外,重组不只是在核基因之间发生,在叶绿体基因间、线粒体基因间也可发生重组;重组也见于噬菌体的整合过程和转座子的转座等的过程中。由此可见,只要有DNA就会发生重组,这表明重组对物种的生存是十分重要的。,一、同源重组/普遍性重组,1.同源重组:依赖大范围的DNA同源序列的联会,重组过程中,两个染色体或DNA分子交换对等的部分。
3、例:同源染色体非姐妹单体交换;细菌的转化、转导、结合;噬菌体的重组,需要重组的蛋白质参与;(例如.大肠杆菌:RecA蛋白、RecBC蛋白) 蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高;(存在重组热点和序列长度的影响) 真核生物染色质的状态影响重组的频率。,1. 进行同源重组的条件,(1)在交换区有相同或相似的序列,同源染色体相同的区域的DNA序列一般相似。同源区越长越有利于重组,大肠杆菌活体重组要求2040bp相同;大肠杆菌与噬菌体或质粒重组同源区要求13bp;等p197,(3)重组酶,使参与重组的DNA发生断裂、重接、修复、重组体释放。,(2)碱基配对,参与重组的DNA互相配对,形成异源双链
4、。,3.功能: A:维持种群的遗传多样性; B:有助于DNA的损伤修复; C:使真核生物产生第一次减数分裂中染色体正确分离到子细胞至关重要的瞬间物理连接。,二、位点专一性重组/保守性重组,原核生物中最为典型 特点: 供体与受体的特定位点的短同源序列之间。 DNA精确切割 连接 DNA不失去、不合成、不交换对等部分(有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中,又称整合式重组),需要位点专一性的蛋白质因子参与。,例如: 噬菌体DNA通过其attP位点和大肠杆菌DNA的attB位点之间专一性重组而实现整合过程。条件:一段15bp的同源序列和位点专一性的蛋白质因子(不能催化其他任何两条不论是同源的还
5、是非同源序列间的重组,从而保证了噬菌体整合方式的专一性和高度保守性,因此又称保守性重组。)而且这一重组不需要RecA 蛋白质的参与。,三、异常重组,完全不依赖于序列间的同源性而使一段DNA序列插入另一段中,但在形成重组分子时往往依赖DNA复制而完成重组过程,因此又称复制性重组。P198 特殊例子:转座,第二节 同源重组的分子机制,一、断裂重接模型(breakage joining model) CDDarlington 1936年提出。 在同源染色体联会时,由于染色体的缠绕而产生张力,两个相对染色单体在同一位置断裂,然后彼此和另一染色单体重新连接起来从而形成重组并消除这种张力。,一 异源DNA
6、分子的断裂与重接,在细胞水平下,同源染色体配对、两条非同源染色体之间发生断裂、重组、交换。,同源重组是参与重组 DNA分子的断裂与链接,二、异源DNA分子的断裂与重接 1. 证据: 1961,M.Meselson and J.J.Wergle两个双标记噬菌体感染大肠杆菌。 (c.mi)噬菌体1 13C和14N “重”链 (+.+) 噬菌体2 12C和14N “轻”链,同时感染,大肠杆菌,子代噬菌体,CsCl密度梯度离心,重链 重链和轻链 轻链,2、几个概念: 重组核心:两个DNA分子的连接 连接分子/接合分子: 重组接点/重组结合点: 杂种DNA/异源双链DNA: 分支迁移:重组接点沿双链移动
7、 交互重组:一条亲本双螺旋分子和另外 一条亲本双螺旋分子共价连接,中间有一端异源双链区,这种重组称为交互重组。,三、同源重组的Holliday model,1964年美国学者Robin Holliday提出了著名的Holliday重组模型。,前提: 参与重组的DNA靠近(同源染色体联会),1、同源重组的Holliday model, 参与重组的两条DNA单链被切断, 切开的3端与另一条链的5端交叉相连接, 交叉点移动,形成异源双链区, 断裂,在交叉点处四条单链DNA都断裂。, 重接,以两种不同的连接方式重接。,原地重接,交换重接, 结果,参与交换的单链DNA中部都有异源区段(heterodup
8、lex )(B/b)。,两侧的标记基因C/c有一半交换(c/c;C/C),2 该模型对重组过程的解释如下: A、同源的非姐妹染色单体联会; B:同源非姐妹染色单体DNA中两个方向相同的单链,在DNA内切酶的作用下,在相同位置同时切开; C:切开的单链交换重接; D:形成交联桥结构;,E:交联桥沿配对DNA分子“移动”。两个亲本DNA分子间造成一大段异源双链DNA( Holliday结构) F:E和F相同; G:绕交联桥旋转1800; J:形成Holliday异构体; I、通过两种方式之一切断DNA单链,若左右切,则形成非重组体,若上下切则形成重组体。 由上可知:无论Holliday结构断裂是否
9、导致旁侧遗传标记的重组,他们都含有一个异源双链DNA区。,HOLLIDAY模型,3 环状DNA分子的重组 两个环状DNA分子配对、断裂、重接形成“8”字型结构中间物,根据切割的位置不同,可分别形成两个亲本环、大的单体环或者是滚环结构。也可以形成“” 结构。,2,3、修改的Holliday model,前三步相同,,第四步的时候先形成一个十字架结构(isomeric Holliday structure ),十字架的分离(断裂-重接)有两种方式, 结果仍然产生一半的重组,十字架的剪切,只需两条链断开,Holliday十字架连接体的电镜照片,4、双链断裂起始重组模型,Double-Strand B
10、reaks in DNA Initiate Recombination,Szostak 等1983年提出,重组是由一系列的内切酶和外切酶发动的。,内切酶与外切酶共同在一对DNA单链上制造一个缺口。,利用另一条同源染色体DNA链为模板进行复制修复。,三、基因转变及其分子机理,重组是一个非常正确的交互过程,在减数分裂的产物中大多数是交互的正常分离,但从大量的分析知道,有时也会出现不规则情况,从而产生少量的异常分离(abnormal segregations)。 对于任何重组模型不仅必须说明正常的重组过程,还必须考虑到这些不规则现象,因此我们在讨论重组的分子基础以前,先说明一下重组模型应当兼顾到的基
11、因转变现象。,(一)异常分离与基因转变,在一个杂合体中,如果一染色体把基因A交给它的同源染色体,则它的同源染色体必定把基因a交回给它,所以在真菌中,一个座位上的两等位基因分离时,应该呈现2:2或1:1:1:1或1:2:1的分离(表8-1),这就说明重组通常总是交互的。可是Lindegren在面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现,有的子囊含有(3A+1a)或(1A3a)的子囊孢子。以后在脉孢霉、酿酒酵母、子囊菌Ascobolus immersus及果蝇中也发现这种现象。,8,Mitchell对子囊菌中出现的异常分离的现象进行了详细的分析。在Mitchell的杂交试验
12、中,所用的基因是关于吡哆醇(pyridoxine,维生素B6)的合成。带有这个基因的突变株需要在培养基上添加吡哆醇后才能生长,且对酸度(pH)敏感,改变酸度后,就无需添加了,这突变基因称作pdxp。在其非常邻近的位点上的另一突变基因pdx,也是吡哆醇需要型突变,但对酸度不敏感。,Mitchell把两个脉孢霉(N. crassa)的吡哆醇突变株杂交, pdxp pdx ,取得子一代子囊后,对585个子囊中的孢子依次解剖出来进行培养和鉴定。他发现4个子囊中,有野生型的孢子对(+),好象这两个位点间有了重组;可是跟预期相反,重组后应该同时出现的双突变型(pdx pdxp)孢子对却没有发现(表9-2)
13、。分析方法是灵敏的,如果有双突变型的话,是能够检出的,并且也不可能是突变,因为它们出现的频率比这些位点的正常突变率高很多。,55,在正常情况下,由于重组,在出现完全野生型孢子对(+ +)的同时,也应出现对应的重组产物-双突变型孢子对(pdx pdxp) 。然而如图9-1B发生的情况,好象pdxp转变成了pdxp(或+),这些不寻常的情况,好象是由于一个基因转变为它的等位基因,所以将这种情况称为基因转变(gene conversion)。图9-1中以 表示pdxp基因发生了基因转变。,在粪生粪壳菌(Sordaria fimicola)中也发现有基因转变现象。Olive等对g座位进行了广泛的研究,
14、g-的子囊孢子为灰色,而g+的子囊孢子为黑色。g+ g-杂交,在所分析的200,000个子囊中,绝大部分属于正常的4g+ : 4g-类型,但也发现有0.06%是5:3分离,0.05%是6:2分离,还有0.008%是3:1:1:3或异常的4:4分离。,A,A,A,A,a,a,a,a,粪生粪壳菌(Olive): GA ga,GA 非重组孢子对,Ga ga,GA gA,ga非重组孢子对,重组孢子对,一个孢子基因转变,重组孢子对,一个孢子基因转变,在异常的4:4子囊中,虽然也是有4个g+和4个g-,但排列方式特殊,一个孢子对中的两个孢子有着不同的基因型,而在正常情况下,它们应有相同的基因型,因为每一孢
15、子对都是一次有丝分裂的产物。此外,在粪生粪壳菌中,虽然g/+这对等位基因表现不寻常的分离,但是邻近的基因A/a都呈现正常的分离(图9-3)。从粪生粪壳菌的基因转变资料可以看出,它有个重要的特点:即在有基因转变的子囊中,基因转变和遗传重组都发生在同样两个单体的子囊比例竟高达90%(图9-3),换句话说,基因转变跟遗传重组是有关的,这也是基因转变与基因突变的差异。,虽然g/+这对等位基因表现不寻常的分离,但是邻近的基因A/a都呈现正常的分离,在发生基因转变产生异常4:4分离(3:1:1:3)和5:3分离的粪生粪壳菌中, 与g+/g-基因邻近的A/a基因(用灰底表示A,白底表示a)呈2:2正常分离,
16、(二) 基因转变的类型 染色单体转变:2:6或6:2分离比 减数分裂4个产物中,一个出现基因转变 半染色单体转变:5:3;3:1:1:3 减数分裂四个产物中,一个或2个的一半出现基因转变 减数分裂后分离:等位基因的分离发生在减数分裂后的有丝分裂中,(三)基因转变的分子机制,基因转变的实质:重组过程中留下的局部异源双链区,在细胞内的修复系统识别下不同的酶切/不酶切产生的结果。不同的切除会产生不同的结果。,一对同源染色体有4个染色单体,每一染色单体是一条DNA双链,所以一对同源染色体有4条DNA双链。在晚偶线期和早粗线期染色体配对时,同源非姊妹染色单体的DNA分子配合在一起;核酸内切酶识别DNA分
17、子上的相应断裂点(breakage point),在断裂点的地方把磷酸二酯键切断,使两个非姊妹DNA分子各有一条链断裂;两断链从断裂点脱开,螺旋局部放松,单链交换准备重接;在连接酶的作用下,断裂以交替方式跟另一断裂点相互联结,形成一个交联桥(cross-bridge),这结构又称Holliday中间体(Holliday intermediate);,这交联桥不是静态的,可以靠拉链式活动沿着配对DNA分子向左右移动,其中互补碱基间形成的氢键从一条亲本链改为另一条亲本链,于是移动后在两个亲本DNA分子间留下较大片段的异源双链DNA,这种结构又称为Holliday结构;随后这交联桥的两臂环绕另外两臂
18、旋转成为十字形,并在交联部分断开,消除交联体,恢复为两个线性DNA分子,即形成Holliday结构的异构体(图9-4H);断开方向或沿东西轴进行,或沿南北方向进行(图9-4I);如沿东西方向切断,即上连、下连,则产生的两个异源双链的两侧基因为AB和ab,仍保持亲代类型,如沿南北方向切割,即左连、右连,则两侧基因为Ab和aB,产生两个重组类型,但不论是那种情况,即Holliday结构断裂是否导致旁侧遗传标记的重组,它们都含有一个异源双链DNA区,有关的两核苷酸区段分别来自不同的亲本,从而由原来的G-C、A-T配对变为G-A、C-T非配对。,从Holliday模型已清楚地表明在对称的异源双链区存在
19、着不配对碱基(如G-A、C-T),这种异源DNA是不稳定的,细胞内的修复系统能够识别不配对碱基,并以其中一条链为模板进行切除修复。在上面的粪生粪壳菌杂交中,假设用于g+ g- 杂交的两亲本仅有一对碱基之差,如:,不相称碱基对,不配对的核苷酸在DNA分子中造成歪斜,不配对的一小段首先由核酸外切酶(exonuc1ease)切除,留下单链的缺口;然后在DNA聚合酶的作用下,以一条链为模板合成具有互补碱基的区段,填补缺口,再由连接酶的作用,把新合成的短链以共价键联接上去,成为连续的核苷酸链,完成修复过程,从而完成修复过程。在修复时,由于切除的不配对碱基区段的不同,可以有下列两种方式图(9-5):如对不
20、相称的碱基对G-A的修复,由于切去的区段的不同,或者在染色单体中形成一个野生型基因(+),或者在染色单体中形成一个突变型基因(g)。,根据切除修复原理,基因转变的几种类型产生的分子机制可以归纳如下(图8-8)。 1两个杂种分子均未校正(图8-8A)复制后出现异常的44g(或3113)的分离。 2一个杂种分子校正为+,或校正为g时,则发生另一种类型的半染色单体转变,前者修复后出现53的分离,后者子囊孢子的异常分离比为35(图8-8B)。,3两个杂种分子都被校正到+(或g)时(图8-8C),修复后出现62g(或26g)的异常分离。这便是出现染色单体转变的起因。 4当两个杂种分子都按原来两个亲本的遗
21、传结构进行修复时,则减数分裂4个产物恢复成G-C、G-C、A-T、A-T的正常配对状态,子囊孢子分离正常,呈现44g的结果,如图8-8D所示。,四、Meselson-Radding模型,Holliday模型中为对称的杂合双链,而实际情况有不均等分离现象,1975年Meselson-Radding 提出模型解释这种不对称重组现象: 1.单链切断 2.链置换 3.单链入侵 4.泡切除 5.链同化(碎链吸收) 6.异构化Holliday 7.分支迁移,五、负干涉,负干涉: 两个邻近基因,尤其一个基因不同突变点间,双交换的频率比预期高,并发系数C1,即一个区域的交换引起邻近区域交换的增加。 局部负干涉
22、: 负干涉的形成原因是存在并不伴随两侧遗传标记重组的基因转变。,第三节 细菌的同源重组,一 、细菌同源重组的特点 细菌的接合、转化以及转导重组都是同源重组,而且这种重组是发生在一个完整的环状双螺旋DNA分子与一个双链或单链DNA分子片段之间的。且重组需要3种基因所编码的RecA和RecBC蛋白质。,RecA蛋白:多功能蛋白 1.NTP酶活性:存在单链DNA时, RecA具水解ATP/dATP活性,促进联会。 2. 单链DNA结合活性:RecA蛋白与单链DNA形成丝状复合物,使其免受核酸酶攻击。 3.DNA解旋活性:DNA为单链或寡聚核苷酸。RecA蛋白在双链DNA的单链切口处解开双螺旋 4.部
23、分单链DNA区,RecA蛋白促进DNA分子间联会。,RecA蛋白,异源双链区,RecBC:溶解酶(Resolvase)活性,断裂Holliday 结构的交联桥完成重组。,二、细菌转化重组机制,实质:单链DNA片段与完整DNA之间的重组,如下情况: 切除外源DNA无重组 切除受体DNA发生重组 无修复作用 子代细胞出现两种基因型(受体基因型和重组体基因型) *通常采用有利于重组体基因型生长的选择条件,高效率标记(high-efficiency maker):在转化中,有些遗传标记或是很少发生校正作用,或是校正切除几乎总是在受体DNA上,因此转化频率较高,这类遗传标记称为。 低效率标记( low-
24、efficiency maker ):转化中一些标记的校正切除总是倾向于发生在供体单链上,因而出现很低的转化频率,这类标记称为。,三、细菌的接合与转导中的重组机制,接合重组(Hfr与F-之间进行)部分DNA进入细胞,且只有其中的部分参与重组,需要RecA和RecBC参与,机制与转化重组相似 转导重组 (phage-DNA与细菌之间)双链DNA与完整双链DNA之间的重组,供体DNA以双链进入受体细胞,并且以双链形式整合进入染色体,需要RecA和RceBC参与。,四、 原核生物重组的酶学基础,(1)RecBCD 酶系统与重组起始,RecBCD 复合体是recB、 C、D基因编码的。具有螺旋酶(he
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- 第八 遗传 重组
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