BD流式全面介绍.ppt
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1、流式细胞术简介,For FCM Training,流式细胞术,流式细胞术(Flow Cytometry, 简称FCM)是一种可以快速、准确、客观,并且同时检测单个微粒(通常是细胞)的多项特性的技术,同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒,如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征,并加以定量,流式细胞仪系统,简介 通过流式细胞仪我们可以得到以下信息 - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度,流式细胞仪的光信号,散射光信号 荧光信号,1. 散射光信号,前向角散射光(FSC,Forward Scatter)
2、入射激光的同向散射光信号 细胞相 对大小及其表面积。 侧向角散射(SSC, Side Scatter) 入射激光90角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。,前向角散射光 FSC,Forward Angle Light Scatter,侧向角散射光SSC,散射光,散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据,散点图Dot Plot,lysed whole blood,Review Question,Dead cells are known to be smaller and to exhibit mor
3、e internal complexity than live cells. Which of the populations on this plot would you expect to be dead?,A,B,2. 荧光信号,荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放,转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多,产生的荧光信号越强,荧光检测器,Two-Color Cell Analysis,Which of the three populations has the most Ab A binding sites?,Ab A,A
4、b B,现代流式细胞仪包括,液流系统 聚焦细胞以供检测 光学系统 激发和收集光信号 电子系统 将光信号转化为电信号,并使其数字化以供计算机分析,液流系统,液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处,Sample Flow in Optical Cuvette,Sample,Laminar Flow,Low Sample Flow Rate 12 mL/min,Sheath,Sheath,Sample,Laminar Flow,Sheath,Sheath,Optical Cuvette,High Sample Flow Rate 60 mL/min,Review Question,Which of t
5、he following would cause disturbance in the laminar flow of the optical cuvette? bubbles cellular concentration sample flow rate,Optics,Excitation optics consist of: Lasers Lenses and mirrors that route the laser light to the fluidic stream Collection optics consist of: Filters that direct the signa
6、ls to the appropriate optical detectors,Optical Filters,460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,Longpass Shortpass Bandpass,FACSCalibur光路图,Optics,488 nm,635 nm,Electronics,Converts analog signals to proportional digital signals Computes Height for each pulse Calculates width and a
7、rea Interfaces with the computer for data transfer,Creation of a Voltage Pulse - Analog Signal,Quantification of a Voltage Pulse,Height is a measurement for all parameters. Width = Area/Height,Effect of the Instrument Controls on the Data,Instrument Controls,Detector,FSC detector 250 gain,FSC detect
8、or 350 gain,Review,Data Processing,Review Questions,Which of the following fluorochromes cannot be used with the FACSCalibur? DAPI (ex. 345 nm, emits 455 nm) Propidium Iodide (ex. 536 nm, emits 617 nm) Alexa Fluor 647 (ex. 650 nm, emits 668 nm) What are the three measurements of a particle that can
9、be determined by FACSCalibur? Briefly describe the functions of the fluidics, optics, and electronics systems.,Review Questions,What would happen to the population below if you increased the Red parameter value in the Instrument controls?,Review Questions,Which instrument components ensure that the
10、fluorescence signal of a specific fluorochrome is only measured by a designated detector? For example, APC is only measured by the FL4 detector.,样本处理,细胞悬液的制备,细胞悬液: 分离PBMC、PRP等:操作复杂,分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失,并可能引入某些误差 直接使用外周血、骨髓:最接近生理状况,操作简便,样本用血量小 灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系 实体组织: 病理组织:新鲜样本/石蜡包埋样本 针吸组织:新鲜样本 鞘液、洗液等:清洁
11、无颗粒杂质,步骤一: 选择合适的荧光染料,必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内 荧光素光谱的重叠应当尽量减少,荧光产生过程,Propidium Iodide,400 nm,500 nm,600 nm,700 nm,PI,DNA,Excitation,Emisson,300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm,Fluorescein (FITC),400 nm,500 nm,600 nm,700 nm,Wavelength,Protein,Excitation,Emisson,300 nm 400 nm 500 n
12、m 600 nm 700 nm,Excitation,Emisson,300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm,Phycoerytherin (PE),Protein,Allophycocyanin (APC),Protein,632.5 nm (HeNe),Excitation,Emisson,300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm,FITC和PE荧光光谱,补偿调节前后对比,FL1,FL2,步骤二: 染色,体积 温度 孵育时间 对照,直接染色,Fluorescent probe attached to antibody Specifi
13、c signal: weak Nonspecific binding: low,间接染色,Fluorescent probe attached to a 2nd antibody Specific signal: strong, 5-6 2nd Ab/each 1st Ab; Nonspecific binding: high,Avidin-Biotin method I,biotinylated primary Ab,biotin,avidin,biotinylated dye,步骤三: 数据收集和分析,画图 寻找目标细胞 调整仪器设置到合适的状态 我们可以得到怎样的结果?它们意味着什么?,
14、仪器设置调节,1. 用未染色细胞调整仪器PMT电压,2. 用单染色的细胞调节仪器补偿,关于同型对照,例:一个双色染色的实验 抗体A FITC,抗体B PE 对应的同型对照是IgG1 FITC,IgG1 PE 那么需要准备的是 阴性对照:细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE 单阳性对照: FITC: 细胞加上Ab A FITC, IgG1 PE PE: 细胞加上Ab B PE, IgG1 FITC,数据分析,设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率,平均荧光值,绝对数或抗体结合数,如何设定阴性与阳性的界限,细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面
15、面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析,细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡,在上述信号基础上的细胞分选,流式细胞术的细胞学应用,流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型,CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病,流式细胞仪的科研应用,免疫功能研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 动物性别筛选 海洋与环境微生物分析 染色体分选,流式细胞
16、仪的遗传学应用,细胞DNA, RNA 含量的测定 染色体倍体分析 染色体分离 基因表达产物的生物活性研究 基因转染表达的生物效应 基因表达调控研究 细胞内基因定位 酵母转基因株的筛选 报告基因的定性定量检测 植物遗传学研究 ,What can Flow Cytometer tell us about a cell?,细胞增殖(细胞周期),细胞内DNA含量 增殖相关基因的表达 BrdU的结合 示踪染料,DNA 探针,DNA探针最主要的特点是,它们与DNA含量是成化学正比关系的这样,带有的探针荧光分子的数目就和DNA分子的含量相当,从而检测DNA含量,Nucleic acid Probes,菲啶基
17、 Propidium Iodide Ethidium Bromide 苯甲亚胺 Hoechst 33342 抗生素 Mithramycin, Chromamycin A3 Acridine Orange - AO Pyronyn Y,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA Analysis,DNA content,Count,Normal Cell Cycle,A typical DNA Histogram,G0-G1,S,G2-M,Fluorescence Intensity,# of Events,红色为正常二倍体细胞;黄色为异倍体细胞,增殖相关
18、基因,PCNA(Proliferating cell nuclear antigen) 一种蛋白质,在DNA复制和核苷酸的切除修复中起到作用 Ki-67 - proliferation related antigen Ki-S1 - proliferation related antigen Phospho-histone Cyclin D1, E, A, B1,BrdUrd Incorporation,Bromodeoxyuridine (BrdU) 是一个胸腺核苷的类似物 能够在细胞增殖和细胞周期状态分析中起作用 BrdU能与正在复制周期内的细胞相结合 使用BrdU抗体能够检测到BrdU,
19、BrdUrd Incorporation,细胞分裂的分析,哺乳动物的免疫系统需要有大量的增殖,能够确保抗原特异性的T细胞和B细胞具有足够的增殖速度,能够对付治病生物造成的感染 CFSE是一种示踪染料,能够均等地在两个子代细胞中分布,其结果可以区分出8-10代的子细胞。,Tracing Dye(CFSE),Apoptotic Cell Death - a genetically encoded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosis,Flo
20、w cytometry of apoptotic cell death,细胞散射光 在细胞调亡中,细胞收缩,从而FSC下降,SSC上升或是没有明显变化,Flow cytometry of apoptotic cell death,荧光吸收 细胞的胞膜对于DNA染料的通透性和细胞的活性、死亡和凋亡相关,像PI、EB、Hoechst-33342等,可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞,Flow cytometry of apoptotic cell death,FCM of Caspases 通过抗体和活化的caspase-3片断相结合来检测 使用特异性的caspase-3荧光底物 新的抗原决定基
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