qPCR实时荧光定量PCR.ppt
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1、1.实时荧光定量PCR技术原理及特点 实时荧光定量PCR是将荧光能量传递技术(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)应用于常规PCR仪中,指在PCR反应体系中加入荧光基团或荧光染料,利用荧光信号积累,从而实时监测整个PCR过程,最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析的方法 。,1.1 基本原理 在实时荧光定量PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。 在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平
2、台期。FQ-PCR可行性定量是在PCR扩增的指数期进行的。首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。,域值,Ct,如果检测到荧光信号超过域值则被认为是真正的信号,它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。 Ct(cyclethreshold)值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,Ct值随着起始模板量的增加而线性降低,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。其中横坐标代表起始拷贝数的对数
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