SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt
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1、外源基因在毕赤酵母中表达水平的预测 表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定 分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率,综合性设计性实验-2,第一部分:外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测 第二部分:毕赤酵母蛋白表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定 第三部分:分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率,此实验共包括如下三个部分,在科研和临床中需要大量的蛋白质,这些蛋白不可能由人体组织或体外细胞培养而大规模的获得,人们利用一些低等生物的特点,来生成和获得这些人属蛋白质。 酵母菌是单细胞真核生物,具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点,被认
2、为是表达外源蛋白的合适宿主。 几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp),因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质,已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。毕赤酵母以甲醇为营养来源。 由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素,乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白,以及多种抗体等。,第一部分:外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测,微观的酵母细胞,5AOX1 启动子片段含有AOX1启动子,在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达; -因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列,能使外源蛋白分泌到发酵上清中,更利于外源蛋白
3、的纯化; 多克隆位点含多个酶切位点,为外源基因的插入提供位点; TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号; HIS4为营养缺陷型筛选标志; 3 AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组; 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在E.coli中筛选和复制。,毕赤酵母表达系统中常用载体的基本结构,pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点,1. 载体的3 AOX1区与基因组的AOX1基因的末端发生整合重组,表达载体与毕赤酵母基因组发生重组的两种方式:,2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4基因的末端发生整合重组,甲醇酵母系统高效表达影响因素,载体稳定性:是整合还是粘
4、附到酵母染色体上 基因剂量:单/多拷贝 甲醇利用表型:Muts(利用甲醇慢型), Mut+ (利用甲醇快型) mRNA5端:应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构 AT含量:AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构 表达产物稳定性:分泌表达时,胞外蛋白酶是要影响因素,外源基因的3末端的最低自由能稳定性对于实现目的基因在毕赤酵母中成功高效表达是比较重要的因素,汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组联合北京军事医学科学院李伍举教授课题组建立了一个针对pPIC9表达载体在毕赤酵母中高效表达的数学模型。,模型构建原理,收集40例应用pPIC9载体在毕赤酵母GS115株中表达目的基
5、因的数据。拟定以表达量100 mg/L为界限,将40例目的基因表达水平分为高/低两组。 确认表达载体的翻译终止密码子前后各100bp的序列,据此对每个数据构建200bp的片段。 从上述每个基因的200bp片段,截取9,000个区间,截取方式为X, Y, X和Y在200bp片段的范围为1X100, 和111Y200。 使用RNAfold软件对每个区间计算最低自由能,构建最低自由能矩阵。 使用Tclass程序对最低自由能矩阵进行t检验及判别分析,得到理论上可以判别表达水平高低的6个区间组合。,我们将40例数据按75的比例随机分成两组,多数组应用上述6个区间来建立判别函数,如此重复1,000次,这样
6、我们得到了1,000个判别函数,如第一个判别函数为: HEG1=20.202030.52552X12.35843X21.53122X32.24870X41.19898X51.53908X6 (1) LEG1=14.370280.00749X10.04135X20.87256X32.02204X40.15215X5 0.74495X6 (2) 这里的X1, X2, X3, X4, X5 和X6分别代表区间18,123,31,140,35,150,90,118,90,151和95,135的用RNAfold软件计算的最低自由能(计算温度参数设为30)。 对于每个新数据,为了预测该基因是否能在酵母中高
7、效表达(表达水平大于100 mg/L),可先计算这6个区间的最低自由能,然后运算上述的1,000个判别函数,来评估该基因高效表达的概率。如果在这1,000次的判别分析中,有500次或以上的HEG1大于LEG1,那么这个外源基因为一个表达水平大于100 mg/L的基因,否则就是个表达水平低于100 mg/L的基因。,外源基因在毕赤酵母表达系统中高效表达预测的网页服务器,http:/ 在“sequence”方框中输入由目的基因末端100bp及其后面的载体100bp组成的200bp序列片段; 点击底下的“Evaluation”按钮,在“Evaluation”方框中显示预测的结果; 如果结果显示低于0
8、.5,则可点击“Design”这个按钮,则显示根据密码子使用改造后的序列。,用该软件来预测NGAL在毕赤酵母高效表达的概率,截取NGAL cDNA 3末端最后100bp碱基(包括终止密码子TGA),与pPIC9载体EcoR I位点后100bp碱基(包括EcoR I位点)组成200bp的序列片段, 用RNAfold软件计算18,123, 31,140, 35,150, 90,118, 90,151和95,135 六个区间的最低自由能(RNAfold的温度参数设为30)。 其数值运算于1,000个判别函数,结果表明NGAL在毕赤酵母中高效表达的概率为0.512,虽然0.512仅略高于0.5,但我们
9、仍想通过表达这个基因来验证酵母高效表达的数学模型。,学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 掌握垂直板电泳的操作方法 了解蛋白印迹技术原理和方法,实验目的,第二部分,毕赤酵母蛋白表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定,带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动,这种现象称为电泳。 电泳使用不同的支持介质,早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂;以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜,现在则多用聚丙烯酰胺(PAGE)和琼脂糖凝胶。,电泳的概念和分类,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-met
10、hylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetramethyl ethylenedia mine,简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8,简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2,C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)。,聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素:蛋白大小,形状和电荷。 S
11、DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠)。 1967年,Shapiro等人首先发现,如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小。,SDS-PAGE的原理,SDS的分子式,SDS是一种阴离子去垢剂,SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时,可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS,好比蛋白质穿上带负电的“外衣”,蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。 SDS能断裂分子内和分子间
12、氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,使蛋白复合物分解成多个亚基。 因此在电泳时,蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质(亚基)分子大小。 使聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应。,SDS的作用,当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式: logMW=K-bX 式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,有许多蛋白质是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如胰凝乳蛋白酶)
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