核酸研究进展.ppt
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1、核酸研究进展,内容简介,核酸的发现和研究概貌 核酸基础 基因组与基因组学 核酸结构与结构预测,核酸的发现和研究工作进展,1868年 Fredric Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人肺炎球菌转化试验 1952年Hershey等噬菌体转化试验, 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 1958 Crick提出的中心法则 1968年 Nirenberg发现遗传密码 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法 1985年 Mullis发明PCR 技术 1990年 美国启动人类
2、基因组计划(HGP) 1994年 中国人类基因组计划启动 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架 后基因时代,核酸基础,核酸的分子结构 DNA的结构 RNA的结构,DNA的结构,DNA的一级结构 DNA的二级结构 DNA的三级结构,DNA的一级结构,概念:DNA的一级结构是指DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序。不同的DNA分子(或片段)其一级结构不同,即脱氧核苷酸排列顺序不同,也就是碱基排列顺序不同。 意义:遗传信息 基本结构单位:脱氧核糖核苷酸 连接键:3,5磷酸二酯键 阅读方向:从5 端到3 端,DNA序列分析 (DNA sequencing),双脱氧链终止法 Sanger DNA
3、的自动测序 DNA化学降解法 MaxamGilbert,DNA序列分析简单回顾,DNA测序方法两位科学家的发明起了决定性作用: 第一位是Frederick Sanger,1977年发明的DNA测序方法。 第二位是Leroy Hood和同事Michael Hunkapiller及Lloyd Smith在1986年对Sanger的方法作了改进。Hood的发明自动测序仪。首先用荧光方法取代了放射方法,然后采用激光和电脑来自动读取测序结果。 第一台自动测序仪由Applied Biosystems公司制造成功,一天能够产出4,800个DNA序列碱基。今天,市场上的测序仪仍然采用这种设计。 今天已经趋向于
4、采用毛细管阵列电泳(capillaries arrays electrophoresis)技术。Applied Biosystems的毛细阵列电泳DNA分析仪3730xl能够并行处理96孔板,一天可测出大约200万碱基。,一个长达数十年的专利申请也许会重写发明DNA自动测序仪的历史。 据美国科学杂志报道,位于纽约的一家小型生物技术公司Enzo Biochem ,1982年,申请DNA自动测序专利。今年11月中旬,美国专利和商标局裁定:Enzo Biochem的这项技术含有与1998年授予加州理工学院前任生物学家黎若伊胡德和同事的发明专利相同的发明。胡德等的这项专利为加州理工学院拥有,该技术目前
5、支撑着70亿美元的DNA测序工业。 Enzo经过律师数十年不懈努力赢得这个专利。位于加州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystem)是购买的胡德专利,在2006年公司测序仪的收入为5.4亿美元,加州理工学院因此专利而每年拥有数百万美元的版税收入。专利和商标局的决定让加州理工学院和应用生物系统公司的财务状态处于危险之中。双方就谁是技术的第一发明者争执不已,答案还有待实验室的记录本和日程表公布之后才会出现。,双脱氧链终止法,双脱氧链终止法,DNA的自动测序,DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸,然后进行S
6、anger测序反应,反应产物经电泳(平板电泳或毛细管电泳)分离后,通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光,检测器采集荧光信号,并依此确定DNA碱基的排列顺序。,DNA自动测序结果举例,DNA化学降解法,基本步骤: (1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P; (2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰; (3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链; (4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开; (5)根据放射自显影显示区带,直接读出DNA的核苷酸序列。,真核生物基因组结构特点,1)真核生物细胞内有两份同源的基因组。 2)真核细胞
7、结构基因基因转录产物为单顺反子。 3)大量重复序列: 高度重复序列:106次,包括卫星DNA、反向重复序列和较复杂的重复单位组成的重复序列; 中度重复序列可达103104次,如Alu家族,KpnI,Hinf家族,以及编码区序列如rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因等; 单拷贝或低度重复序列整个基因组中只出现一次或很少几次的核苷酸序列,主要是编码蛋白质的结构基因。 4)间隔序列(intervening sequences),内含子(intron)。 5)具有许多复制起点,每个复制子的长度较小。,原核生物基因组结构特点,基因组较小,形式多样,可能是DNA,也可能是RNA,可能是单链的,也可能是双
8、链的,可能是闭环分子,也可能是线性分子;细菌染色体基因组则常为环状双链DNA分子。 功能相关的结构基因常常串连在一起,并转录在同一个mRNA分子中,称为多顺反子。 DNA分子绝大部分用于编码蛋白质,间隔区通常包含控制基因顺序。 基因重叠是病毒基因组的结构特点。 除真核细胞病毒外,基因是连续的,不含内含子序列。,DNA的二级结构,Watson和Crick双螺旋结构模型 DNA结构的多态性,Watson和Crick双螺旋结构模型,DNA双螺旋结构的多态性,B-DNA与Z-DNA的比较,比较内容 B-DNA Z-DNA 螺旋手性 右旋 左旋 螺旋周期的核苷酸数目 10 12 螺旋直径 20A 18A
9、 碱基平面的间距 3.4A 3.7A 螺距 34A 45A 相邻碱基对间的转角36A 60A 轴心与碱基的关系 穿过碱基对 不穿过碱基对,B-DNA结构参数,性质 X射线衍射分析 STM分析 螺旋的手性 右旋 右旋 螺旋的旋转周期 33.8A *34.4+2A(32-36A) 大沟 宽度 11.7A *间距:22.6A 深度 8.5A 7A 小沟 宽度 5.7A 间距:12A 深度 7.5A 2A 大沟和小沟有关值 的比较 宽度比2.2 间距比1.88,DNA双螺旋结构的多态性,在生理盐溶液中92%相对湿度下是B型双螺旋。 在钾离子相对湿度为75%时,DNA分子是A构象。一般说来,AT丰富的D
10、NA片段常呈BDNA。 用乙醇沉淀法纯化DNA时,DNA由B-DNA经C-DNA,最终变为A-DNA。 若DNA双链中一条链被相应的RNA链所替换,会变成ADNA。 当DNA处于转录状态时,DNA模板链与由它转录的RNA链间形成的双链就是ADNA。 BDNA双链都被RNA链所取代而得到由两条RNA链组成的双螺旋结构也是ADNA。由此可见A-DNA对基因表达有重要意义。 除A-DNA、B-DNA螺旋外,还存在B-DNA、C-DNA、D-DNA等。 总之,DNA的双螺旋结构处于动态平衡中。,DNA结构的多态性,很多研究证明,DNA不仅可以是双螺旋,也可以是三螺旋,还可以是千奇百怪的折叠弯曲。 目前
11、已经发现DNA至少有9种特殊结构,而且随着研究的深入,发现DNA的结构还会增多。相对于现有的经典双螺旋DNA结构,其他DNA结构也许处于非主流地位。 DNA结构的多样性对人类认识人和生物的多样性,以及生命现象的多样性具有关键作用,至少有助于人类治疗疾病、开发新药以及理解生命的本质。,反向重复序列 (inverted repeats),回 文 序 列,富含A/T的序列,在高等生物中,A+T与GC的含量差不多相等,然而在它们的染色体某一区域,AT含量可能相当高。 在很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT,特别是在复制起点和启动子的TATA框的序列中,其对于复制和起始十分重要。因为AT对只有二条氢
12、键,此处的双链较GC对处易于解开,有利于起始复合物的形成。,嘌呤和嘧啶的排列顺序,考察相邻的二核苷酸对,发现碱基组成相同,但嘌呤和嘧啶的排列顺序不同,双螺旋的稳定性具有显著的差异。 例如5GC3,3CG5和5GC3,3GC5,前者的稳定性远大于后者。它们的氢键数目是相同的,它们的差别在于相邻碱基之间堆积力不同。即从嘌呤到嘧啶的方向的碱基堆积作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆集作用。这是因为前者的嘌呤环和嘧啶环重迭面积大于后者的嘧啶环和嘌呤环的重迭面积,这在B型DNA中确是如此。,三螺旋,1957年Davies等首次根据试验结果提出三螺旋核酸的概念。 70年代初,Arrnott等根据
13、X射线衍射结果,建立了三螺旋核酸简单分子模型。 三螺旋DNA的结构单元是三碱基体,有两种基本类型: 一种是嘧啶-嘌呤-嘧啶型三碱基体(Py-型) ; 另一种则是嘌呤-嘌呤-嘧啶三碱基体(Pu型) 。 1987年irkin等在酸性溶液的质粒中发现-型三螺旋, 1987年ervan等通过将第三股粘接到天然上。结果表明,三螺旋的形成可能伴随于转录、复制和重组等细胞过程。,三螺旋DNA不是DNA在自然态下的主要结构,而是在特定的条件下形成的。 它是由一条ODN通过与双链DNA形成Hoogsteen键或反Hoogsteen键,在其大沟处紧密缠绕而成。 具体就是富含嘧啶的ODN与双链DNA的富含嘌呤的链以
14、平行的方式键合,形成Hoogsteen键; 富含嘌呤的ODN与双链DNA的富含嘌呤的链以反平行的方式键合,形成反Hoogsteen键。,Hoogsteen键或反Hoogsteen键的形成只是构筑三螺旋的必要条件;要想使三螺旋具备一定的生物学功能,实现它的实际应用,还必须保证它具有一定的稳定性。 影响三螺旋DNA稳定性的因素可分为内部因素和外部因素两方面。内部因素主要是指链长、碱基序列组成、骨架本性等因素。这些因素主要是通过影响第三条链键合时碱基配合的强度、氢键相互作用的强度以及双链受体重排时的能量大小来影响所形成的三螺旋的稳定性的。碱基错配对三螺旋稳定性的影响很大。 影响三链核酸稳定性的外界因
15、素主要包括溶液的pH值、溶液中阳离子的浓度、配基结合作用力的大小等。,“嘧啶型”或嘧啶-嘌呤-嘧啶(YRY)型三螺旋,Arnott等提出的三螺旋为A型DNA,糖环构象是N型(C3-endo),一个周期含有12个核苷酸,平均碱基高度为32.6nm,有较负的X位移(-32nm)。 Howard等根据红外光谱及偏端霉素A的嵌入实验提出YRY型构象上采取B型,其糖环构象是C2-endo(S型),3条核苷酸链都有相同的糖-磷酸主链构象。在两个反平行的T链间存在一个二重对称轴。d(T)nd(A)nd(T)n的B型结构比A型在能量上更优越, 同时Raghunathan等给出了B型三螺旋结构模型的初始坐标。分
16、子模型和振动谱的研究表明在d(G)nd(G)nd(C)n和d(G)nd(A)nd(T)n三螺旋中,S型和N型糖环构象都存在,糖环的二面角在anti区。d(C)n链是S型,Watson-Crick中的d(G)n链是N型。 然而,三螺旋究竟是A型还是B型或者是两者的混合体还需要进一步实验去证实。,“嘌呤型”或嘌呤-嘌呤-嘧啶型(RRY)三螺旋中,第三条嘌呤链以反平行于Watson-Crick双螺旋嘌呤链的方向缠绕到双螺旋的大沟上,专一性地与嘌呤链结合。 早期,在利用光谱学和超分离测量方法探索三链复合物时发现了GGC和IIC两种RRY型三螺旋。 后来,Fresco等用亲和色谱法确认RRY型三螺旋中也
17、包括AAUI、IAUT和IGC三螺旋。 随后,又确认了GGC、AGC和TAT 3种典型的RRY型三螺旋,以及CAT、AGC和TCG等相互作用较弱的三螺旋。研究发现RRY型三螺旋(CAT、AGC和AAT等)第三条嘌呤链和Watson-Crick双螺旋的嘌呤链以两个反-Hoogsteen氢键相连接,且糖环的二面角限制在anti区。 核磁共振研究RRY型内含一个TCG三碱基体,分子内三链DNA,分子内三链DNA是由一条单链通过自身回析形成的,其结构中含有两个loop环,为了满足形成过程中对极性以及碱基配对的要求,这条单链必须具有特殊的序列,即其序列要具有镜像重复性(mirror repeat). 例
18、如,对PyPuPy型三链,两条嘧啶链相对于中间的嘌呤链来说具有镜像对称的关系。 由于分子内三链的各条链都位于同一分子内,所以与分子间三链相比,它更易于形成。,H-DNA,H-DNA又称铰链DNA,1987年由Mirkin等在一种持粒的酸性溶液中首次发现。H-DNA可在任何以镜象重复的寡聚核苷酸中产生(核苷酸序列具有H回文结构)。 H-DNA是由部分未缠绕的复合DNA中的一个富嘧啶链,经回折同复合体中伸展的富嘌呤链间形成Hoogsteen氢键而形成的分子内三螺旋,即DNA的双链所形成的三链螺旋。由于形成过程中发生CC+的转化,故称H-DNA。并把这类序列称为H回文序列。,H-DNA,研究还发现在
19、毫摩尔级的Mg2+和中性pH下,d(G)30d(C)30所形成一种由GGC三碱基体组成的嘌呤分子内三螺旋结构(H*-DNA),而另外一些研究则发现d(AG)nd(T)n和d(G)nd(C)n束道也能形成同时含有H-DNA和H*-DNA的纽结(nodule)三锭结构。在这个DNA结构中,两个三螺旋的顶端含有少数几个未配对的DNA碱基,而且由于不同结构间存在大量的链节,因此,纽结DNA的形成具有较高的成核能,但延伸能较低(因为单链区较少)。,R-DNA,Lacks 1996年曾提出了一种三碱基体,其中第三条链上的碱基不仅与双螺旋嘌呤链上的碱基相互作用,同时也与第一条链上的嘧啶碱基相互作用。 Zhu
20、rkin等在研究活体的基因重组时又提出了这种不同于YRY和RRY型三螺旋的三链复合物。 近年来发现在RecA核蛋白纤维内接合处有三链复合体并作为同源重组的中间体,这种三链复合物被称为R-DNA。第三条链定义为R链,和双螺旋中的一条链(W-链)相同且平行。在这三螺旋中。对应三碱基体的第三条链上的碱基位置靠近双螺旋Watson-Crick碱基对的二重轴;从而与另外两个碱基都发生相互作用。同时R-链上每一个碱基的电荷分布严格与W-C碱基对大沟上的碱基电荷电性互补,同源序列的相互识别可能是通过互补的静电相互作用进行的,即含有静电识别密码。,三螺旋的稳定性,核苷酸结构:寡聚核苷酸序列的组成和长度 溶液条
21、件,三螺旋的检测,紫外-可见分光光度法: 三螺旋解链和双螺旋解链的两个转变温度可作为三螺旋形成的标准 荧光分析法 许多荧光染料不仅可用于检测双螺旋,也可用于检测三螺旋,从双螺旋向三螺旋转变的过程会诱导荧光强度下降,可用于检测三链的形成 原子力显微技术 原子力显微镜可以直接观察吸附在云母和金表面上的,根据的宽度和高度来判定三螺旋是否形成。,三链DNA的应用,60年代,人们对DNA、RNA以及DNARNA的杂台三螺旋结构进行了广泛的研究。 Morgen等(1968)首先研究了RNA作为第3条链, 在体外大肠杆菌体系中三螺旋的形成对转录的抑制作用。 Moser等(1987)证明在5 端携带EDTA
22、Fe()的寡聚核苷酸可以导致双螺旋特定位点的断裂,产生类似限制性酶的作用,但催化效率远远比不上真实的体内限制性酶。,三螺旋DNA作为生物的分子工具,通过特定位点的切割和诱导突变可以操纵基因,有助于我们研究基因图谱和基因功能。三螺旋DNA可以作为基因调节剂。当形成三螺旋的寡聚核苷酸(简称TF0)结合到一个靶基因上能够阻止RNA的转录,抑制靶基因的表达。三螺旋DNA战略优势在于它能够利用TFO直接结合到基因上来抑制基因表达, 而不必结合到mRNA上, 也就是说, 三螺旋DNA可以直接在转录过程而不必到翻译过程起作用。,在细胞体系的生物化学方面的研究,三螺旋DNA的研究在细胞体系的生物化学方面已经取
23、得了初步进展。 c myc致癌基因在真核细胞生长和繁殖的调节过程中起着重要的作用。C- myc基困的过度表达与多种恶性肿瘤有关。最初在核细胞中的转录抑制研究表明,TFO能降低c-myc基因的转录。Postel等(1991)研究表明, 在细胞体系的生理pH值和温度下也能产生同样的效果。最近的研究还证明,TFO可以抑制人类免疫缺乏病毒(HIv)基因组的表达。,反义寡核苷酸类药物,是应用反义寡核苷酸类药物通过WastonCrick碱基配对与细胞内核酸(DNA或认)特异结合形成杂交分子,从而在转录和翻译水平抑制特定基因表达的技术。 反义寡聚核苷酸(ASO)技术是用单链RNA 或DNA 来改变mRNA的
24、新陈代谢从而调节从基因到蛋白质的信息。 ASO可结台到靶基因上而不影响其它基因, 这一特点使得ASO 成为了解蛋白质生物功能的一个有利工具。 反义RNA比反义DNA长得多, 而且有不止一个结合位点, 可能还会产生非专一性序列的作用 反义DNA在细胞液中更稳定屿,但它的作用是瞬时的。,义寡核苷酸类药物的机制,反义寡核苷酸与靶mRNA结合形成DNA-RNA杂合分子,可以激活RNase H,该酶可以切割杂合分子中的RNA链,导致靶mRNA降解。 不能激活RNase H活性的反义寡核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译 ASODN的作用是在DNA结合蛋白(如甲基化酶、激活子、限
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