第八章+酶免疫技术.ppt
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1、,第八章 酶免疫技术,教学目的要求: 1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或抗原;熟练掌握固相载体。 2.熟练掌握酶免疫技术的分类 3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及原理 4.掌握酶免疫测定的应用,放射免疫技术,荧光免疫技术,酶免疫技术,三大经典标记技术,三大经典标记技术,基本原理,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,酶标抗体(抗原)与抗原(抗体)的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,第一节 酶免疫技术的特点,基本原理,酶标抗体(抗原)与抗原(抗体)的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,第一节
2、 酶免疫技术的特点,一、酶和酶作用底物,(一)标记酶的要求: 活性高,纯度高 作用专一性强 性质稳定,易与抗原或抗体偶联 测定方法简便易行、敏感、精确 酶和底物对人体无害 酶和底物价廉易得,辣根过氧化物酶(HRP),糖蛋白(主酶) 亚铁血红素(辅基) 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心,RZ值:403nm (辅基) 与275nm(主酶)OD值之比,纯度数(RZ)值与酶活性无关,酶活性单位(U)比RZ值更为重要,酶的纯度并不代表酶的活力,国内以辣根过氧化酶最为常用,1、辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase ,HRP),(一)常用的酶,DH2+H2O2 D+2H2O,供
3、氢体DH2习惯上被称为底物,底物有多种,H2O2为受氢体,HRP对受氢体的专一性很高,HRP催化的反应式为:,HRP,邻苯二胺 OPD反应后显橙黄色,加酸终止反应后呈棕黄色,测定波长492nm。不稳定,有致癌性。,四甲基联苯胺 TMB反应后显蓝色 ,加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ,稳定,无致癌性,ELISA中应用最广泛的底物。,HRP常用底物,(二)碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,AP),是一种磷酸酯水解酶,从大肠杆菌提取,AP的 底物,对-硝基苯磷酸酯( pNPP ),经AP作用后的产物为黄色对硝基酚,最大吸收峰波长为405 nm。,敏感性高于HRP,但
4、不易获得高纯度的制品、稳定性差,价格贵,(三)-半乳糖苷酶 (-galactosidase,-Gal),源于大肠埃希菌 ,常用于均相酶免疫测定。,-Gal 的底物,4-甲基伞酮基-D半乳糖苷( 4MUG ),酶作用后,生成高强度荧光物 ,用荧光计测量。,二、酶标记抗体或抗原,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物 酶标记物,通过化学反应或免 疫学反应,让酶与 抗体或抗原形成的 结合物,(一)酶标记抗体或抗原的制备,标记方法要求,技术方法简单、产率高,重复性好,标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性,酶标记物稳定 ,不易发生解离,制备方法,2.过碘酸钠氧化法 常用于HRP标记抗体或抗原,1.戊二醛交联法
5、 适合各种酶蛋白的标记。,(二)酶标记物的纯化与鉴定,1酶标记物的纯化,标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物,避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)的竞争作用。,常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。,2.酶标记物的鉴定,(1)免疫活性鉴定:常用免疫电泳或双向免疫扩散法,出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有免疫活性。,(2)酶标记率测定:用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量,然后按公式计算其标记率。,三、固相载体,固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法,固相抗体或抗原:
6、就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面,(一)固相载体的要求,结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行,快速经济,(二)固相载体的种类,1塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状。主要有微量反应板、小试管和小珠三种。,2微颗粒 微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒。,3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料,包括硝酸纤维素膜(NC)、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。,微量反应板,(三)包被与封闭,将抗原或抗体固相化结合在固相载体上的过程称为包被(coating)。,以聚笨乙烯固相载体(如制ELISA板)为例说明免疫吸附的过程: 抗原(抗体)
7、用PH9.6的碳酸盐溶液稀释 4C过夜 用10%的小牛血清再包被一次,以消除固相载体表面未吸附的位点,此过程叫做封闭。,24,第二节 酶免疫技术的分类,克隆酶供体免疫测定,酶免疫分析技术,酶免疫组织化学技术,酶免疫测定技术,均相酶免疫测定,异相酶免疫测定,酶放大免疫测定技术,液相酶免疫测定,固相酶免疫测定: 酶联免疫吸附试验(ELISA),组织切片或其它标本中抗原的定位分析,液体标本中抗原或 抗体的定性和定量,一、均相酶免疫测定法,酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。 未与抗原(抗体)结合的标记抗体(抗原),称为游离标记物。 与抗原(抗体)结合的标记抗体(抗原),称为结合标记物。,一、均相酶免
8、疫测定法,基本原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后,其中的酶活性将发生改变。,因此,不需对反应液中结合和游离的酶标记物进行分离,直接测定反应系统中总酶活性的变化即可推算出被测样品中抗原的含量。,二、异相液相酶免疫测定法,基本原理:抗原抗体反应平衡后,需采用适当的方法分离游离的和结合的酶标记物,然后对经酶催化的底物显色程度进行测定,再推算待测样品中抗原(或抗体)的含量。依据测定方法又可分为液相和固相酶免疫测定。目前临床上多用固相酶免疫测定法。,第三节 酶联免疫吸附试验(ELISA),一、基本原理,底物显色 定性或定量的分析,包被 将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面,反应 加入待测抗体或 抗原和
9、酶标抗原 或抗体,洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离,1,2,3,4,二、方法类型及反应原理,(一)检测抗原的方法,将己知抗体包被固相载体,待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合,洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合,形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物,根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。,1.双抗体夹心法,双抗体夹心法检测抗原,适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原,(1)将已知抗体包被于固相反应板上,洗涤。 (2)加待检标本,温育,洗涤。 (3)加酶标抗体,洗涤。 (4)加底物,根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。,2技术要点,底物,(
10、+),双抗体夹心法测抗原,2.双位点一步法检测抗原,即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体,分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应,两种抗体互不干扰,经一次温育和洗涤后,即可加入底物进行显色测定。,双位点一步法检测抗原,在包被时使用一种单抗,酶标记时使用一种单抗,3.加酶作用的底物 显色,2.加待检抗原 和酶标抗体,1.已知抗体包 被载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,(+),3.加酶作用的底物 不显色,2.加待检物(无抗 原)和酶标抗体,1.已知抗体包 被载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,
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