第八章动物基因组学基础.ppt
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1、第八章动物基因组学基础,1 基因组学概述 2 基因组图谱的构建 3 基因组测序 4 基因定位方法 5 功能基因组学,第一节 基因组学(genomics)概述,基因组(genome)又称染色体组,二倍体物种配子所含的染色体数目,物种全部遗传信息的总和 物种遗传信息的“总词典” 控制发育的“总程序” 生物进化历史的“总档案”,基因组学1986年提出 基因组学强调的是以基因组为单位,而不是以单个基因为单位作为研究对象 基因组学的重要组成部分是基因组计划,如人类、水稻基因组计划,人类基因组计划,1990,美国国立卫生研究所和能源部投资30亿,启动了被誉为“人体阿波罗计划”的“人类基因组计划”(huma
2、n genome project,HGP),预计15年时间完成人类基因组全部序列的测定 在美国提出人类基因组计划后,英、法、日、前苏联、中等,也相继启动了类似的研究项目 2000,完成草图 2002,完成测序工作,基因组计划大体可分为:,构建基因组的遗传图谱 构建基因组的物理图谱 测定基因组DNA的全部序列 构建基因组的转录本图谱 分析基因组的功能,基因组学的研究内容,结构基因组学(structural genomics) 基因定位、 基因组作图、 测定核苷酸序列 功能基因组学(functional genomics),又称后基因组学(postgenomics) 基因的识别、鉴定、克隆 基因结
3、构、功能及其相互关系 基因表达调控的研究 蛋白质组学(proteomics) 鉴定蛋白质的产生过程、结构、功能和相互作用方式,第二节 基因组图谱的构建,基因组计划的主要任务是获得全基因组序列 但是,现在的测序方法每次只能测8001000bp 大量的测序片段要拼接 要知道序列在染色体上的位置才能正确拼接 基因组计划的第一个环节: 构建基因图谱,基因组图谱,基因组图谱:描述基因位点在染色体的线性排列顺序及它们之间的相对距离 遗传图谱(genetic map) 物理图谱(physical map),一、 遗传图谱 遗传图谱(genetic map):根据遗传性状(如已知基因位点、功能未知的DNA标记
4、、可鉴别的表型性状)的分离比例将其定位在基因组中,构建相应的连锁图谱。通常以交换过程中的分离频率厘摩(cM)来表示。cM值越大,两者之间距离越远,(一)遗传标记 图谱构建中需要可以鉴别的标记(marker) 遗传标记(Genetic Markers):是指能够用以区别生物个体或群体及其特定基因型,并能稳定遗传的物质标志 基因标记:用基因作为标记,分析各基因间的连锁关系及遗传距离,绘制出连锁遗传图谱 DNA标记:RFLP、SSLP、SNPs等 包括形态标记、细胞学标记、生化标记、DNA分子标记,形态标记,形态性状:株高、颜色、白化症等 又称表型标记 数量少 很多突变是致死的 受环境、生育期等因素
5、的影响,最早建立的果蝇连锁图,就是利用控制果蝇眼睛的形状、颜色,躯体的颜色、翅膀的形状等形态性状作为标记,分析它们连锁关系及遗传距离,绘制而成的 控制性状的其实是基因,所以形态标记实质上就是基因标记,果蝇连锁图,细胞学标记,明确显示遗传多态性的染色体结构特征和数量特征 染色体的核型 染色体的带型 染色体的结构变异 染色体的数目变异 优点:不受环境影响 缺点:数量少、费力、费时、对生物体的生长发育不利,生化标记,又称蛋白质标记,就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记 如:同工酶、等位酶 优点:数量较多,受环境影响小 缺点:受发育时间的影响、有组织特异性、只反映基因编码区的信息,DNA分子标记,简称分
6、子标记,以DNA序列的多态性作为遗传标记 优点: 不受时间和环境的限制 遍布整个基因组,数量无限 不影响性状表达 自然存在的变异丰富,多态性好 共显性,能鉴别纯合体和杂合体,理想的分子遗传标记应具备的特点,遗传多态性高 检测手段简单快捷 易于实现自动化 遗传共显性,1.限制性片段长度多态性-第一代DNA遗传标记 (restriction fragment length polymorphism,RFLP),最早的DNA标记 限制性酶切位点:被特定的内切酶所识别的4个或更多个碱基组成的特异性序列 DNA序列能或不能被某一酶酶切,相当于一对等位基因的差异 可将RFLP作为标记,定位在基因组中某一位
7、置上 人类基因组中有105个RFLP位点,每一位点只有两个等位基因,RFLP 分析过程,RFLP 分析结果,RFLP 标记的特点,可靠重现性好 目的序列已知时才能检测 操作复杂自动化程度低 耗时长至少需要2天,通常3-7天 多态信息含量低,PCR-RFLP,PCR,电 泳,酶 切,基因型,2.VNTR,基因组中存在大量重复序列 重复单位长度在15-65个核苷酸左右的小卫星DNA 在酶切片段里边核心序列重复次数不同导致酶切片段长度的差异 又称为DNA指纹 与 RFLP 分析方法类似,利用探针杂交检测 区别在于酶切位点不在可变重复区,而在侧翼区,VNTR 分析过程,VNTR 检测结果,VNTR 标
8、记的特点,多态性检测率高一个探针可以检测出十几个甚至几十个位点的多态信息 位点呈共显性遗传 个体具有高度特异性 技术复杂,实验成本高 有时谱带过于复杂,难于分辨,VNTR 应用,计算遗传距离 杂种优势预测 亲子鉴定 - 1/10000 (99.99% likely) 法医鉴定 - 1/10,000,000,3.微卫星-第二代DNA遗传标记 (short tandem repeat ,STR),重复单位长度在2-6个核苷酸之间的微卫星DNA(microsatellite DNA),又称为简短串联重复(SSR、STRP或SSLP,short sequence repeat polymorphism
9、或者simple sequence length polymorphism) STR有两个最突出的优点,即作为遗传标记的“多态性”与“高频率” 如一条染色体TCTGAGAGAGACGC 另一染色体TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC,就构成了多态性,STR 标记检测方法,需要根据保守的侧翼序列设计特异性扩增引物 PCR 反应扩增 STR 区域 PCR产物用变性聚丙烯酰胺胶分离 不同的核心序列重复数导致不同长度的PCR产物,STR 标记特点,核心重复单位为 2 - 6 个碱基 在基因组中分布更加广泛均匀 多态信息含量丰富 呈共显性遗传 稳定性好,分析技术易于自动化,比Southern杂法
10、更快捷 DNA用量少 甚至部分降解的样品也可用于检测 易受基因组污染的影响 必须事先了解侧翼序列才能设计引物 标记开发成本较高,4.RAPD-随机扩增多态性DNA,应用10bp 的引物进行PCR 每个反应只设单条引物 短的引物随机结合在染色体上 当引物结合在双链1000bp左右的区域时,该片段被扩增,RAPD 检测结果,RAPD 标记特点,PCR反应产物通过电泳分离:不同样品间可能存在差异 主要用于分析群体间的遗传距离 引物短,不同生物基因组可以共用一套引物 实验快速简便,成本低,无需预先了解基因组DNA序列 退火温度低,实验重复性差,可比性不强 标记呈显隐性遗传,无法判定杂合子和显性纯合子,
11、5.AFLP,基于PCR技术扩增基因组DNA的限制性片段 结合了RFLP和PCR技术特点,具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性 基因组DNA先用限制性内切酶切割,然后将双链接头连接到DNA片段的末端,接头序列和相邻的限制性位点序列,作为引物结合位点,进行扩增 AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段。所以是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术,是指染色体上的某个位点存在单个碱基的变化 SNP不再以DNA片段的长度变化作为检测手段,直接以序列变异作为标记。 SNP遗传标记分析完全屏弃了经典的凝胶电泳,代以最新的DNA芯片技术,是人类基因组“遗传图”发展方向,6.单核苷酸的多态性-第三
12、代DNA遗传标记 (single nucleotide polymorphism,SNP),SNPs 标记特点,高密度1000bp左右出现1个SNP 代表性存在cSNP 易于自动化测序、基因芯片等方法,(二)遗传图谱的构建,理论基础: 连锁与交换 基本方法: 两点测验法和三点测验法,连锁分析,进行连锁分析的三个要件 用于基因定位的作图群体 广泛分布的多态性遗传标记 适宜的定位分析方法和软件,1.参考家系,用于连锁分析的动物群体,也称为作图群体 可以是:回交群体、F2群体、半同胞家系,标记间的连锁分析,利用在两个亲本间有多态性的标记分析分离群体中所有个体的基因型 根据连锁交换的情况,确定标记之间
13、的连锁关系和遗传距离 有计算机软件可以应用,人类遗传图谱的构建,不可能根据需要选择亲本,设计杂交组合,构建分离群体 只能检测现存家庭连续几代成员的基因型 家系分析法 资料有限、必须借助于统计学方法,现有的人类遗传图谱,122号染色体 8个家系134个成员 X染色体,12个家系170个成员 5364个SSR标记 2335个位点 标记间的平均距离599kb,二、物理图谱(physical map),用分子生物学方法直接检测DNA标记在染色体上的实际位置绘制成的图谱称为物理图谱 以碱基对(bp,kb,Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图 有遗传图谱为什么还要构建物理图谱?,遗传图谱的缺陷,分辨率
14、有限 人类只能研究少数减数分裂事件,不能获得大量子代个体 测序要求每个标记的间隔小于100kb,实际是599kb 精确性不够 经典遗传学认为,交换是随机发生的 基因组中有些区域是重组热点 倒位、重复等染色体结构变异会限制交换重组,物理作图的方法,基因组物理图谱的构建主要有三种途径: 限制性酶图谱 荧光原位杂交技术(FISH) 序列标签位点(STS) 如表达的序列标签(EST),来自cDNA,限制酶作图 (restriction mapping),描述染色体上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱 识别位点较多的内切酶:如Not,其8个核苷酸出现的频率为1/48=1/65536bp,而识别位点
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