何水林版基因工程第三章分子克隆载体.ppt
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1、第三章 分子克隆载体(Molecular cloning vectors),周毅峰 2013春,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,在基因工程中,通常是把外源DNA片断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(Vector)。,载体(Vector),载体的本质是DNA。 经过人工构建的载体,不但能与外源基因相连接,导入受体细胞,还能利用本身的调控系统,使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineer
2、ing 第三章分子克隆载体,基因工程中常用的主要载体,质粒(Plasmid),主要指人工构建的质粒,噬菌体载体,柯斯质粒 (cosmid),单链DNA噬菌体M13,动物病毒,人工染色体 (artificial chromosome),2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性),具有合适的
3、筛选标记,具有较高的外源DNA的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,克隆载体 (cloning vector),对目的基因克隆,建立DNA文库和cDNA文库,其上有复制子即可,按功能分类,表达载体 (expression vector),使目的基因在宿主细胞中表达,既有复制子,又有强启动子,穿梭载体 (shuttle vector),可以在原核细胞中复制,也可在真核细胞中扩增和表
4、达。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,第一节 质粒 (Plasmid),质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA,一般大小约106108D,可自身复制和表达。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,基因克隆载体的质粒DNA分子,必定包括:,复制基因、选择性记、克隆位点。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1 质粒的基本特性,2 质粒DNA的分离纯化,4 重要的大肠杆菌质粒载体,3
5、 质粒载体的构建及类型,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.1 质粒DNA的构型,两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构,称为共价闭合环形DNA(cccDNA),通常呈现超螺旋的SC构型,只有一条DNA链出现有一至数个缺口,称为开环DNA(ocDNA),此即OC构型,线性分子DNA(IDNA),称为L构型,1 质 粒 的 基 本 特 性,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.2 质粒DNA分子大小,2012年3月,基因工程中
6、Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.3 质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系,根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)的多少,质粒可分为两大复制类型:,严紧型质粒(stringent plasmid) 在宿主细胞中拷贝数少的质粒,1数个拷贝,松弛型质粒(relaxed plasmid) 在宿主细胞中拷贝数多的质粒,10个拷贝以上,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,低或单拷贝质粒的复制必需由复制子本身编码一个必不可少的顺式作用蛋白(repA)来对复制起点作
7、正调控作用,如psc101等,同时其复制受宿主蛋白合成的影响。所以这些质粒的拷贝数不能通过诸如氯霉素等蛋白质合成抑制剂来增加拷贝数,1) 松弛复制型,多拷贝质粒(pMB1或ColE1等)的复制不受宿主菌蛋白合成的影响的影响;当蛋白质合成不能进行时,复制依然进行,2) 严紧型复制,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,How many copies can be replicated ?,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,Negative control,positive control,answers,Re
8、pressor model: cop factor,Antisense RNA model: RNA,RNA,Rep protein,pMBl/colEl复制子,pSC101复制子,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,RNA和RNA复制copies的调节,RNA由ori上游的550到下游的200转录出约为750nt的RNA,RNA由RNA基因反义链编码的108nt的RNA,与RNA互补, 控制复制引物与模板的结合,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,RNA在RNaseH的作用下加工成550nt的成熟引物,起
9、始复制,RNA5端产生一个富含G的环与ori上游20bp处的富含C区互补,+150,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,此处复杂的RNA二级结构的正确折叠是复制起始的关键,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,RNA与RNA互补后,不能起动复制,质粒复制依赖于宿主酶活性,一旦开始复制则不能自主控制自制速度和进程,故必须在复制启动前或启动时由RNA来控制,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,RNA-1 0,When RNA-2,200-360Nt,Rom gene e
10、xpression, RNA- / RNA-D.S. repression,RNA- / RNA-,不能形成primer的 3-OH,促进,限 制,63 aa ROP (Rom protein),RNA- 只能转录到100-220 base, 不能到达“0”原点,不能形成primer 的3-OH,0,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,RNA和RNA之间“亲吻复合物”的放大。 由RNAI和RNA形成稳定的复合物通过抑制RNA与DNA稳定杂交体的形成而阻止DNA合成。,与Rom/Rop二聚体蛋白结合,使RNA I与RNAll形成稳定的“亲吻”复合物。,
11、Rom RNAmodulator(调节器) Roprepressor of primer,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体, 控制复制起始因子与复制起始位点(ori)的结合,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,质粒载体及其拷贝数,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性,它是指在第二个质粒导入后,在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不
12、相容的质粒一般都利用同一复制系统,从而导致不能共存于同一宿主中。,1.4 质粒的不相容性,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,不相容性的质粒组成不相容性群,以大肠杆菌的质粒为例:,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构,彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构,彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构,彼此不相容,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,质粒的不相容性:分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒,在复制时受到同一种,拷贝数控制系统的干扰,致使两种质粒的最终拷贝数
13、不同,,两种含有不同复制子结构的不同质粒,在复制时各受自己的,拷贝数控制系统的调节,致使两种质粒的最终拷贝数恒定,,因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一,细胞内,其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.5 质粒DNA的转移,G细菌质粒,接合型的质粒(conjugative plasmid),非接合型的质粒(non-conjugative plasmid),接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到,另一个细胞(接合作用),如F、Col、R质粒等,如Col、R的其它成员,非接合型质
14、粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,F质粒,大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子(fertility factor)或性因子(sex factor)决定的F因子,具有这种因子的能育品系记为F,相当于雄性。不含这种致育因子F的品系记为F,相当于雌性。,F+细胞的F因子通过接合管向F细胞转递 使F变成F,F因子还可改变细胞表面的构造,以防F细胞间的接合。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,R质粒 也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因,此种抗性通常
15、能转移到缺乏该质粒的受体细胞,使后者也获得同样的抗菌素抗性能力,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,Col质粒: 此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因,即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白,它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.6 携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因,这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状,包括:,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机
16、碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,按其用途可将标记基因分为,选择标记基因,筛选标记基因,用于鉴别目标 DNA (载体)的存在,将成功转化了载体的宿主挑选出来,可用于将特殊表型的重组子挑选出来。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.6.1 选择标记,氨苄青霉素抗性基因(Ampicillin resistance gene, ampr),四环素抗性基因(Tetracycline resistance gene, tetr),氯霉素抗性基因(chloram
17、phenicol resistance gene, Cmr, cat),卡那霉素和新霉素抗性基因 (kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor),琥珀突变抑制基因 supF,蔗糖致死基因 SacB,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体, 氨苄青霉素抗性基因 (Ampicillin resistance gene, ampr),氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记,绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成,与有关的酶结合并抑制其活性,抑制转肽反应。,201
18、2年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合,从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白,可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外,还带有四环素抗性基因。, 四环素抗性基因 (Tetracycline resistance gene, tetr),2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体, 氯霉素抗性基因 (chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat),氯霉素可与核糖体 50
19、S 亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性 P1 噬菌体(也携带 Tn9)。 cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶,一个四聚体细胞质蛋白(每个亚基 23kDa)。在乙酰辅酶 A 存在的条件下,该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物,使之不能与核糖体结合。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体, 卡那霉素和新霉素抗性基因 (kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor),卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷,都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种
20、编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3)-, 25kDa)的基因,氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化,从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔,保护宿主不受这些抗生素的影响。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,在基因的编码区中,若某个密码子发生突变后变成终止密码子,则称这样的突变为赭石突变(突变为 UAA),或琥珀突变(突变为 UAG),或乳白
21、突变(突变为 UGA)。 supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA ,可在 UAG 密码子上编译酪氨酸。, 琥珀突变抑制基因 supF,如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和 ampr 基因,只有当宿主含有 supF 基因时才会对 Amp 和 Tet 具有抗性。,supE 基因在 UAG 密码子上编译谷氨酰氨。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,来自淀粉水解芽胞杆菌 (Bacillus amyloliquefa- ciens) ,编码果聚糖蔗糖酶。 在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死的,因此该基因可用于插入失活筛
22、选重组子。, 蔗糖致死基因 SacB,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.6.2 筛选标记基因,筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒 当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时,可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒,即重组质粒。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,乳糖操纵子(lac operon),大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的 lacZ 基因编码 -半乳糖苷酶(-galactosidase),如果 lacZ 基因发生突变,则不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。, -互补(-compleme
23、ntation),2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,lacZ:只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基因 ,其产物也没有酶学活性。,lacZM15 基因是缺失了编码 -半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因,无酶学活性。,当这两个无酶学活性的产物混合在一起时,可恢复 -半乳糖苷酶的活性,实现基因内互补。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,在 lacZ编码区上游插入一小段 DNA 片段(如 51 个碱基对的多克隆位点),不影响 -半乳糖苷酶的功能内互补。 若在该 DNA 小片段中再
24、插入一个片段,将几乎不可避免地导致产生无-互补能力的 -半乳糖苷酶片段。,利用这一互补性质,可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,异丙基-D- 硫代半乳糖苷(IPTG)是乳糖的衍生物,可作为 lac 操纵子的诱导物,但不能作为反应的底物;,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,乳糖既是 lac 操纵子的诱导物,也是作用的底物,乳糖及其衍生物可诱导lacZ 表达。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,5-溴-4-氯-3-吲哚
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