何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定.ppt
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1、,第五章 基因的转移与重组体的 筛选和鉴定,一、粘性末端的连接,DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起 单酶切、双酶切,第一节 DNA的体外重组,DNA的体外重组:将目的基因与载体连接,这种重新组合的DNA称为重组DNA。,(一) 直接连接,T4 DNA连接酶虽然能连接平末端,但效率很低,只有粘性末端的110%。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,二、平末端(blunt end)的连接,(1)同聚加尾法,(二) 人工加尾形成 “粘性末端”,DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的
2、3-OH端加上脱氧核苷酸。, 原理:,分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。, 加尾碱基互补,缺点:,优点:,能把任何片段连接起来,操作繁琐; 外源片段难以回收; 同聚物尾巴影响外源基因表达。,非酶切位点,(2)衔接物(linker)连接,Linker:,用化学合成法合成的一段10-12bp的,具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸,GGAATTCC CCTTAAGG,EcoR I linker:,(二) 人工加尾形成 “粘性末端”,(1)多核苷酸激酶处理,(2)T4连接酶连接,(3)限制性内切酶消化,(4)目的片段与载体连接,(二) 人工加尾形成 “粘性末端”,(3)DNA接
3、头 (adapter)连接法, adapter,一头平末端、另一头粘性末端(某种酶切位点序列),Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 3HO-GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5p-GATCCCGG- GGCC-,-CCGG -GGCCCTAG-P5,接头与接头以粘末端连接,影响与DNA片段的连接, 优点:,连上后就能用。, 缺点:,先用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理接头,水解掉其5端的磷酸,防止自我连接。, 防止自我连接,5p-GATCCCGG- GGCC-,CCGG GGCCCTAG-p5,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCG
4、G-3 GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5HO-GATCCCGG- GGCC,CCGG -GGCCCTAG-OH5,5HO-GATCCCGG3 GGCC-OH5,nick缺口,nick缺口,HO-,-OH,CIP处理,T4 ligase,虽然有缺口,但仍然能与DNA片断连接 T4多核苷酸激酶处理使5磷酸化,三、PCR产物的连接,1.在引物的5端设计酶切位点,符合载体的多克隆位点;,(1)设计原则,(2)带酶切位点的引物的结构,3端1520bp与模板互补; 5端内切酶识别序列保护碱基,避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。,三、PCR产物的连接,1.在引物的5端设计酶
5、切位点,请设计一对PCR引物,在N端和C端分别加一个EcoRI(GAATTC,保护碱基GCA)和BamHI酶切位点(GGATCC,保护碱基CGC),另外,各含有18个同该基因同源的核苷酸,能够用于扩增该基因的编码序列。写出P1和P2的引物序列。,带酶切位点的PCR产物,GCAGAATTC,PCR产物,5-,-3,CCTAGGCGC,PCR产物,-5,3-,CGTCTTAAG,GGATCCGCG,EcoR I位点,BamH I位点,AATTC,PCR产物,5-,-3,CCTAG,PCR产物,-5,3-,G,G,EcoR I,BamH I,两头各有一个粘性末端!,A,A,dNTP,T,T,dTTP
6、,Taq DNA聚合酶,载体,PCR产物,TA,TA,三、PCR产物的连接,2. 与T载体直接连接,三、Gateway 载体构建系统,噬菌体位点特异性重组系统; 高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。,入门克隆,改造过的各种表达载体,三、Gateway 载体构建系统,(1)创建入门克隆 BP反应:attB+attP attL+attR,产物:入门克隆,入门克隆,改造过的各种表达载体,三、Gateway 载体构建系统,(2)构建表达克隆 LR反应:attL+attR attB+attP,产物:表达克隆,入门克隆,改造过的各种表达载体,第二节 重组体导入受体细胞,一、重组DNA导入大肠杆菌,(
7、一)转化(transformation),大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。,(三)转染(transfection),受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。,(二)转导(transduction),借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。,(一)转化(transformation),(1)热激法(heat shock),(2)电转化法(electronporation),(3)PEG介导的原生质体转化,(4)接合转化,制备感受态细胞,增加受体菌细胞膜的通透性,(1)热激法, 目的,感受态细胞:处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞,制备感受态细胞,1、将处于对数生长期的细菌置于0的CaCl2低渗溶液中
8、,细胞膨胀成球形,处于感受态; 2、将感受态细胞与DNA混合,Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物,粘附于细胞表面; 3、经42短时间热激处理,细胞吸收DNA复合物; 4、在培养基中生长数小时之后,球形细胞复原并增殖。,(1)热激法, CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理,10ng 载体DNA,100L 感受态细胞,冰浴30min,42 12min,加入1mL LB培养基 (Amp-),37 振荡培养1h,10-100L转化液涂Amp平板,吸附DNA,摄入DNA,操作步骤: (p140),转化率:106-108/g DNA,(2)电转化法,原理:在高压脉冲下,细菌细胞
9、表面形成暂时性微孔,重组DNA通过微孔进入细胞后,脉冲结束,细胞恢复原状。 实验简单,不需要制备特殊的感受态细胞,“感受态”:清洗处理,在低温下使细胞处于无离子区且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中,保证电击过程中细胞不被击穿而死亡。,转化率:1091010/ g DNA,(二) 转 导,由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程,(三) 转 染,噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒,直接被感受态细胞捕获的过程。,与转化无本质区别,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌,形成噬菌斑。 每g DNA能形成106个噬菌斑,现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染,体外包装过程,二、重组DNA导入真核细胞,(一
10、)导入酵母细胞,原生质体转化 碱金属离子介导的完整细胞转化 PEG1000转化法 电击法,(二)导入植物细胞,(三)导入动物细胞,1. 利用原生质体进行转化,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2 PEG,插入外源基因的载体,共转化:将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法,转化,转化细胞达原生质体总数的1%2%,转化率受再生率影响 共转化的原生质体占转化子总数的25%33%,酵母,0.1mol/L LiCl处理,感受态,2. 碱金属离子介导的完整细胞转化,热激,涂布选择性平板,筛选转化子,吸收线性DNA能力明显大于环状DNA,两者相差80倍 转化率:103个 / g DNA;共转化现象极
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