分子克隆.ppt
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1、分子克隆 南京农业大学 动物医学院基础兽医系动物生化教研室 医学分子生物学基础 1 第五章 分子克隆 重组DNA技术(recombinant DNA technology) 是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组,再将 重组分子导入受体细胞,使其在细胞中扩增和繁殖 ,以获得该DNA分子的大量拷贝。 克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲 代完全相同的子代群体。 2 载体和目的基因的分离; 载体和目的基因的切断; 载体和目的基因的重组; 重组DNA的转化和扩增; 重组DNA的筛选和鉴定。 第一节 基因工程技术路线 3 基因重组技术的两个基本目的: 1.直接利用基因 主导生长的基因、
2、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。 2.利用基因的表达产物 疫苗、药物、 组织激活物、 生长因子、 珍稀蛋白等。 第一节 基因工程技术路线 4 工具酶:指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统。 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 第二节 分子克隆常用的工具酶 5 工 具 酶功 能 限制性核酸内切酶识别特异序列,切割DNA DNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键,使DNA切口 封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶合成双链cDNA分子或片段连
3、接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3末端 Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段,具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活 性,而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成,双链DNA 3末端标记 等 反转录酶合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补,标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化,或标记探针 末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶切除末端磷酸基 第二节 分子克隆常用的工具酶 6 一、限制性内切酶 酶有几千种,分为6大类:氧化还原酶、转移酶、水解酶 、裂合酶、异构酶、连接酶。 基因工程中常用作用于核酸的酶,包括水解酶、修饰酶、
4、 聚合酶等 水解酶分为内切酶和外切酶 内切酶在核酸链内部切割,生成寡核苷酸;外切酶从核酸 链的末端开始,渐进式地水解核酸链,逐渐释放单核苷酸。 第二节 分子克隆常用的工具酶 7 有特定的识别序列 但切割位置远离识别位置 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割DNA 分子 在基因工程中没有什么用途 型限制酶 第二节 分子克隆常用的工具酶 8 型限制酶 有特定的识别序列 切割位置在识别序列3端相距20bp处,可以产生各种类型的 单链末端。 型限制酶在基因工程中有特定的用途,但总体来说,用途不 大。 第二节 分子克隆常用的工具酶 9 型限制酶 在DNA上有特定的识别序列 而且其切割
5、位点就在识别序列内部 基因工程中用途最广 识别序列是对称的,在一条链中从5到3方向的序列与其互补 链从5到3方向的序列完全相同,称为回纹对称序列 (palindrome)。 第二节 分子克隆常用的工具酶 10 限制性内切酶的命名 属名种名菌株类型发现的顺序 第二节 分子克隆常用的工具酶 11 限制性核酸内切酶 具有内切和甲基化两种功能 能够识别外源的核酸并将它切除 有特异的识别位点,通常为4-6对碱基的旋转对称结构在其切口处留下黏性 末端(sticky end)具有互补序列的单股链,或者平头末端(blunt end) 有3种类型,II型为主。 第二节 分子克隆常用的工具酶 12 第二节 分子克
6、隆常用的工具酶 13 EcoRI酶切不同来源 的DNA及退火重组 第二节 分子克隆常用的工具酶 14 第二节 分子克隆常用的工具酶 15 第二节 分子克隆常用的工具酶 16 同尾酶:即识别序列不同,但酶切后产生同样的黏性末端的两种酶。 同裂酶:来源不同, 但能识别和切割同一 位点,但在切点位置 上对甲基化碱基的敏 感性不同。 第二节 分子克隆常用的工具酶 17 第二节 分子克隆常用的工具酶 18 限制性内切酶的主要用途 重组DNA分子 匹配末端的连接:同一种酶切割不同DNA分子产生相同的突出 末端;或不同酶切割不同DNA分子产生相同的突出末端,可在连接酶 作用下连接为重组DNA分子。 平端连接
7、:可直接连接,但效率较低。 不匹配黏端的连接:先补平(Klenow)或修平(S1)后再连接。 绘制物理图谱(限制性内切酶图谱) 第二节 分子克隆常用的工具酶 19 影响限制性核酸内切酶活性的因素: DNA的纯度。 DNA的甲基化程度。 酶切消化反应的温度。 DNA的分子结构。 限制性核酸内切酶的缓冲液。 第二节 分子克隆常用的工具酶 20 DNA连接酶 大肠杆菌 NAD T4噬菌体 ATP 来源 辅基 第二节 分子克隆常用的工具酶 21 DNA连接酶功能 1.修复双链DNA上缺口处的磷酸二 酯键。 2.修复与RNA链结合的DNA链上缺 口处的磷酸二酯键。 3. 连接多个平头DNA双链分子。 第
8、二节 分子克隆常用的工具酶 22 从分子动力学的角底讲,由 限制性内切酶创造的粘性末端的 连接属于分子内部的连接,而平 头末瑞则属于分子间的连接,因 此后者速度要慢的多。 第二节 分子克隆常用的工具酶 23 DNA聚合酶 基本性质 5-3、DNA聚合酶活性 5-3核酸外切酶活性 3-5核酸外切酶活性 第二节 分子克隆常用的工具酶 24 缺口前移标记法制备32P标记的探针 Nick translation DNA聚合酶功能 第二节 分子克隆常用的工具酶 25 DNA聚合酶大片段 基本性质 大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大 肽段,即为Klenow酶。 具有: 5-3D
9、NA聚合酶活性 3-5核酸外切酶活性 失去 5-3核酸外切酶活性 第二节 分子克隆常用的工具酶 26 DNA聚合酶大片段功能 补平由核酸内切酶产生的5粘性末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列 第二节 分子克隆常用的工具酶 27 T4-DNA聚合酶 基本性质 5-3DNA聚合酶活性和3-5的核酸外切酶活性 在无dNTP时,可以从任何3-OH端外切 在只有一种dNTP时,外切至互补核苷暴露时为止 在有四种dNTP均存在时,聚合酶活性占主导地位 第二节 分子克隆常用的工具酶 28 T4-DNA聚合酶功能 切平由核酸内切酶产的的3粘性末端 DNA片段的
10、同位素末端标记 第二节 分子克隆常用的工具酶 29 反转录酶 reverse transcriptase 1.以RNA为模板,聚合形成cDNA链。 2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链 第二节 分子克隆常用的工具酶 30 核酸酶S1 l 可以降解单链DNA和RNA。 l 降解单链DNA比降解双链DNA快75000倍。 l 降解单链DNA比降解单链RNA快7倍。 l 反应最适pH范围为4.0-4.3. 第二节 分子克隆常用的工具酶 31 核酸酶S1功能 内切单链DNA或RNA 内切带缺口或裂口的双链DNA或RNA 第二节 分子克隆常用的工具酶 32 末端脱氧核苷酰转移酶 来自小牛胸腺
11、不需要模板的DNA聚合酶,随机掺入dNTP 第二节 分子克隆常用的工具酶 33 碱性磷酸酶 来自小牛胸腺(CAP) 来自大肠杆菌(BAP) 功能:将DNA或RNA片段的5端的磷酸基切除 第二节 分子克隆常用的工具酶 34 第三节 分子克隆常用的载体 为了能够在寄主细胞中进行繁殖,必须将DNA片段连接到一种特定的、具有自 我复制能力的DNA分子上。这种DNA分子就是基因工程载体(vector)。 载体的本质是DNA(少数为RNA)。 质粒(plasmid) 噬菌体的衍生物 动物病毒 细菌人工染色体 酵母人工染色体 35 载体应具备的条件 n 能在宿主细胞中大量复制,得到大量的重组DNA分子 n
12、载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个(置换型载体上被置换 片段的两侧各有一个内切酶位点) n 克隆载体要有复制起点,表达载体要有启动子 n 载体上要有报告基因或选择标记基因 n 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 n 具有较高的外源DNA装载能力。 第三节 分子克隆常用的载体 36 克隆载体 克隆了外源DNA后,转入宿主细胞中进行繁殖,使 克隆的DNA片段数量大大增加 表达载体 将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达蛋白质 插入型载体 将外源基因或DNA插入其中 置换型载体 切除载体部分DNA,代之以外源基因或DNA。 第三节 分子克隆常用的载体 37 质粒 质粒是生物
13、细胞内固有的、能独立于寄主细胞染色体外而自主复制、并被 稳定遗传的一类核酸分子。 绝大多数质粒是DNA型的,天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结 构,即cccDNA。 基因克隆的载体质粒DNA分子都具有复制子、选 择性标记、克隆位点。 第三节 分子克隆常用的载体 38 质粒的命名 小写p代表质粒(plasmid),后接两个大写字母代表发现者或实 验室,字母右方数字代表质粒的编号。 pBR322 质粒 F. Bovlivar R.L.Rodriguez 编号 第三节 分子克隆常用的载体 39 质粒与宿主细胞的关系 (1)质粒对宿主的生存不是必需的,只是“友好”的“借居”宿主细胞中 ,既不杀
14、伤细胞,对宿主的代谢活动也无影响,宿主离开质粒照样的生存下 去。 (2)质粒离开宿主就无法生存,只有依赖宿主细胞的(酶和蛋白质)帮助 ,才能完成自身的复制(扩增)、转录。 (3)质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能,作为对宿主细胞的补偿( “交房租”)。 (4)质粒赋于宿主各种有利的表型(质粒编码蛋白质或酶),使宿主获得 生存优势,与我们基因工程实验紧密相关的,如抗生素抗性基因: 第三节 分子克隆常用的载体 40 质粒发现和研究意义 1)理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息,从分子遗传学观点来看 是一种有机体,是比病毒更原始的生命形式,是生命起源研究的起一块体重要是生命起源研究的起一块体
15、重要 基石。基石。 2 2)实践意义)实践意义 是基因工程的重要载体(是基因工程的重要载体(vector vector),),能把外源基因(目的基能把外源基因(目的基 因)送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。因)送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。 质粒是可以改造的,可以剪切、剪接的,基因工程的重要任务之一就是严 格改造质粒的同时,控制质粒不传递,若一个致癌质粒可以传递就会传到处都 是。 第三节 分子克隆常用的载体 41 质粒的分类 1.1.按质粒的复制机理按质粒的复制机理,分为,分为2 2类:类: 1)严谨控制型(stringent contrd type) 2)松弛控制型(relaxed
16、control type) (1)拷贝数少,一般15kb15kb 小型质粒,无接合和自传递能力,在接 多属接合型或自传递型,大型质粒只 合质粒协助也能转移,也可心通过转化 能通过细菌的接合作用由一个细菌 作用进入受体细胞,这类质粒种类较多, 传到另一个细菌。(如F质粒)。 几乎每种细菌都可以含有2种以上,基因基因 工程一般用小型质粒。工程一般用小型质粒。 第三节 分子克隆常用的载体 43 3.3.按质粒转移方式,分为按质粒转移方式,分为3 3类类 1)接合型质粒(conjugaative plasmid)带有效接触基因质粒,只能使细菌接 合,本身不被传递. 2)可移动质粒(mobiliable
17、plasmid)可以被传递,但不能使细菌接合。 3)自传递质粒(selftran missible plasmid)兼具1)2)两种功能因而可以自 传递,如F质粒。 第三节 分子克隆常用的载体 44 质粒的功能 质粒的功能主要通过质粒本身携带的基因编码蛋白质表现出来。携带质粒的宿 主细胞可表现出相应表型。 1.1.性质粒性质粒 即细菌F质粒,它本身转到F-宿主细胞时,使后者变成F+,改变宿主细 菌性别。 2.2.抗生素抗性抗生素抗性 抗药性(R)质粒使细菌产生抗生素抗性,这种抗药性抗性基因也 可以转移到缺乏这种抗药基因的细菌体内,使之产生抗药性。 3.3.产生毒素的质粒产生毒素的质粒 如col
18、质粒能产生大肠杆菌素因子(colicin),杀死不含该 毒素的亲缘细菌。 第三节 分子克隆常用的载体 45 质粒的基本特性 1.1.自主复制自主复制 质粒的复制是自主调节的,不受染色体复制调节因素的影响质粒的复制是自主调节的,不受染色体复制调节因素的影响。 复制调控系统由质粒上的复制起点(ori),质粒的rep基因和cop基因组成 。 Rep蛋白启动质粒的复制,cop基因本身或其表达产物可抑制复制作用,从 而控制质的拷贝数。 2.2.质粒的不相容性质粒的不相容性 利用相同复制系统的质粒不能共存于同一个细胞内利用相同复制系统的质粒不能共存于同一个细胞内。 PMB和COLEI是两个密切相关的复制调
19、控系统,带有PMB和COLEI复制调控系统 的质粒是不相容的。但它们与带有PSC101或P15A复制调控系统是完全相容的, 可以共存于一个细胞内。不相容性使质粒能够很容易被克隆。 3.3.质粒的转移性质粒的转移性 在自然条件下,在些质粒可以通过细菌接合作用在细菌 细胞间传递。基因工程中常用的质粒载体缺乏转移所需的基因(mob基因), 不能通过接合作用在细胞间传递,但可采用人工方法转化到细菌细胞中。 第三节 分子克隆常用的载体 46 质粒的构建 天然存在的质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点小、遗传标记 不理想等缺点,不能满足克隆载体的要求,因此往往需要以多种野生型质粒 为基础进行人工构建。
20、 第三节 分子克隆常用的载体 47 pSC 101 一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒 载体,平均每个寄主细胞仅有12个拷贝,编码 有一个四环素抗性基因(tetr)。 pSC101质粒不仅具有可插入外源DNA的多个 限制性核酸内切酶的单克隆位点,而且还具有四 环素抗性的强选择记号,因此,它被选为第一个 真核基因的克隆载体。当然,这个质粒载体也有 其明显的缺点,它是一种严紧型复制控制的低拷 贝质粒,从带有该质粒的寄主细胞中提取 pSC101 DNA,其产量就要比其它质粒载体低 得多。 第三节 分子克隆常用的载体 48 ColE1 属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常生长 条件下,当培养
21、基中用于蛋白质合成的氨基酸被 耗尽,或是在对数生长末期的细胞培养物中加入 氯霉素以抑制蛋白质的合成,寄主染色体DNA 的复制便被抑制,细胞的生长也随之停止。此时 ,松弛型复制控制的质粒DNA仍然可以继续进 行复制达数小时之久,使每个寄主细胞中所累积 的ColE1质粒拷贝数增加到10003000个之多 。由此可见,由于质粒拷贝数高,插入的外源 DNA片段的产量也就得到相应的提高。 第三节 分子克隆常用的载体 49 pBR322 pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的: 第一部分来源于pSF2124质粒转座子的氨苄青霉素抗性基因(ampr); 第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因(
22、tertr); 第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点(ori)。 第一个优点:具有较小的分子量,不仅易于纯化,而且 即使携带上一段6-8kb的外源DNA片段,操作起来仍较 为便利。 第二个优点:具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的 选择记号。 第三个优点:具较高的拷贝数,若经过氯霉素扩增,每 个细胞中可累积10003000个拷贝,为重组体DNA的 制备提供了极大的方便。 第三节 分子克隆常用的载体 50 pUC pUC系列质粒载体包括如下四个部分: 来自pBR322质粒的复制起点;氨苄青霉素抗性基因; 大肠杆菌-半乳糖 酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序
23、列; 位于lacZ基因中 的一段多克隆位点(MCS)区段,它并不破坏该基因的功能。 第三节 分子克隆常用的载体 51 pGEM-3Z pGEM-3Z是一种与pUC系列十分类似的小分 子质粒载体,总长度为2,743bp,编码有一个 氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。 pGEM-3Z具有两个来自噬菌体的启动子,即 T7启动子和SP6启动子,它们为RNA聚合酶的 附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两 个启动子分别位于lacZ基因中多克隆位点区的 两侧,故若在反应试管中加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶,所克隆的外源基因便会转录出相 应的mRNA。 第三节 分子克隆常用的载体 52 大肠杆菌
24、-酿酒酵母穿梭质粒载体 含有两种分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复 制起点与选择标记。它使研究工作者可以自 如地在这两种不同的寄主细胞之间来回转移 基因,并单独或同时在两种寄主细胞中研究 目的基因的表达活性及其它调节功能。例如 ,可将酵母的某种基因亚克隆到穿梭质粒载 体上,置于大肠杆菌中进行定点突变处理后 ,再把突变体基因返回到酵母细胞,以便在 天然寄主中观察研究此种突变的功能效应。 第三节 分子克隆常用的载体 53 噬菌体或病毒DNA 噬菌体或病毒是一类非细胞微生 物,能高效特异性地转染宿主细 胞,然后或自主复制繁殖,或整 合入宿主基因组中潜伏起来,而 且在一定条件下上述两种状还会 相互转化。
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