分子生物学复习.ppt
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1、1 一、蛋白质化学一、蛋白质化学 (一)氨基酸(一)氨基酸 蛋白质的氨基酸组成蛋白质的氨基酸组成编码氨基酸:编码氨基酸:2020种种/ /受遗传密码控制受遗传密码控制 非编码氨基酸:翻译后加工非编码氨基酸:翻译后加工 编码氨基酸结构特点编码氨基酸结构特点构件分子:构件分子: L,L,-氨基酸氨基酸 除除GlyGly外,其余都是外,其余都是L,L,-氨基酸氨基酸 ProPro为亚氨基酸为亚氨基酸 R R基团的不同是分类的基础基团的不同是分类的基础 编码氨基酸分类编码氨基酸分类酸性氨基酸酸性氨基酸 碱性氨基酸碱性氨基酸 中性氨基酸中性氨基酸 2 咪唑基 胍基 吡咯环 结构特点:结构特点: 1.1.
2、含苯环含苯环: phe: phe 2.2.含酚羟基含酚羟基: Tyr: Tyr 3.3.含吲哚环含吲哚环: Trp: Trp 4.4.含羟基含羟基:Ser Thr:Ser Thr 5.5.含硫含硫: Cys Met: Cys Met 6.6.含胍基含胍基:Arg:Arg 7.7.含咪唑基含咪唑基: His: His 3 ( (二二) ) 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质 两性电离两性电离 等电点等电点(pI(pI) 在水溶液中能两性电离而成兼性离子在水溶液中能两性电离而成兼性离子 分子呈电中性时的溶液的分子呈电中性时的溶液的pHpH值值 紫外吸收紫外吸收 芳香族氨基酸特有芳香族氨基酸特有(ph
3、e(phe,Tyr,Trp)Tyr,Trp) 吸收峰:波长吸收峰:波长280nm280nm 茚三酮反应茚三酮反应 加热加热 氨基酸氨基酸 + + 茚三酮茚三酮 蓝紫色化合物蓝紫色化合物 (570nm)(570nm) ProPro + + 茚三酮茚三酮 黄色化合物黄色化合物 氨基酸的定量方法氨基酸的定量方法 4 (三)蛋白质的结构层次(三)蛋白质的结构层次 一级结构一级结构从从N-N-端到端到C-C-端氨基酸(残基)排列顺序端氨基酸(残基)排列顺序 是蛋白质的基本结构是蛋白质的基本结构 是空间结构、生理功能的基础是空间结构、生理功能的基础 维系键维系键 肽键肽键/ / 二硫键二硫键 二级结构二级
4、结构肽链主链骨架原子局部空间结构肽链主链骨架原子局部空间结构 螺旋螺旋/折叠折叠/转角转角/ /无规卷曲无规卷曲/ /模体模体 维系键维系键 氢键氢键 三级结构三级结构肽链主链、侧链骨架原子局部空间结构肽链主链、侧链骨架原子局部空间结构 (结构域(结构域/ /分子伴侣)分子伴侣) 球状或椭圆状蛋白质球状或椭圆状蛋白质 亲水表面和疏水内核亲水表面和疏水内核 大部分蛋白质到三级结构已有生物活性大部分蛋白质到三级结构已有生物活性 例如:肌红蛋白例如:肌红蛋白 、免疫球蛋白、免疫球蛋白 维系键维系键 疏水键疏水键 四级结构四级结构蛋白质分子中各个蛋白质分子中各个亚基亚基的空间排布的空间排布 举例:血红
5、蛋白(举例:血红蛋白( 2 2 2 2 ) 维系键维系键 离子键离子键 5 模体(模体( motifmotif) 蛋白质分子中蛋白质分子中2 23 3个二级结构肽段,在空间上有个二级结构肽段,在空间上有 规律地聚集起来,形成相对稳定、特殊的空间构规律地聚集起来,形成相对稳定、特殊的空间构 象象 具有特殊的生理功能具有特殊的生理功能 例如:例如:-环环- 钙结合蛋白钙结合蛋白 锌指锌指 结构域结构域分子量大的蛋白质三级结构可分割成分子量大的蛋白质三级结构可分割成1 1个和数个个和数个 球状或纤维状的区域球状或纤维状的区域 具有功能具有功能 例如:酶的活性中心例如:酶的活性中心 6 分子伴侣分子伴
6、侣空间构象的决定因素之一空间构象的决定因素之一( (一级结构一级结构/ /分子伴侣分子伴侣) ) 本质是蛋白质本质是蛋白质( (热休克蛋白热休克蛋白Hsp70/Hsp70/异构酶异构酶) ) 提供一个保护环境提供一个保护环境 加速蛋白质折叠成天然构象或四级结构加速蛋白质折叠成天然构象或四级结构 亚基亚基在蛋白质的在蛋白质的四级结构四级结构中,每个各中,每个各具独立三级结具独立三级结 构构的多肽链称为亚基的多肽链称为亚基 亚基单独存在不具有生物活性亚基单独存在不具有生物活性 7 一级结构是决定三维结构一级结构是决定三维结构 和生物学活性的基础和生物学活性的基础 牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶的变性和复
7、性实验的变性和复性实验 比较几种氨基酸顺序相似的比较几种氨基酸顺序相似的 蛋白质空间结构和生物学活性蛋白质空间结构和生物学活性 蛋白质结构与功能的范例蛋白质结构与功能的范例肌红蛋白肌红蛋白: :三级结构三级结构 血红蛋白血红蛋白: :四级结构四级结构 ( (别构效应别构效应/ /氧解离曲线呈氧解离曲线呈S S形形) ) 蛋白质折叠蛋白质折叠 需要分子伴侣需要分子伴侣/ /伴侣蛋白伴侣蛋白 天然非折叠蛋白质天然非折叠蛋白质 ( (内在非结构蛋白质内在非结构蛋白质) ) 天然蛋白质天然蛋白质, ,没有完全折叠成特定没有完全折叠成特定 三级结构三级结构, ,但具备功能但具备功能 与其他蛋白质相互作用
8、与其他蛋白质相互作用, ,具有功能具有功能 多样性多样性 8 (四)蛋白质的理化性质(四)蛋白质的理化性质 蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离 大多数人体蛋白质大多数人体蛋白质pI=5.0pI=5.0 在在pH7.4pH7.4环境下成环境下成阴离子阴离子 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质水化层水化层 电荷层电荷层 蛋白质变性和复性蛋白质变性和复性变性变性: :空间结构破坏空间结构破坏, ,一级结构不变一级结构不变, , 生物学活性丧失生物学活性丧失 蛋白质紫外吸收蛋白质紫外吸收 =280 nm =280 nm 有特征性吸收峰有特征性吸收峰 蛋白质定性、定量方法蛋白质定性、定量方法 9 蛋白质的变
9、性蛋白质的变性 vv变性因素变性因素vv物理或化学因素物理或化学因素 vv机制机制 vv蛋白质空间结构破坏蛋白质空间结构破坏 vv一级结构未破坏一级结构未破坏 vv性质的变化性质的变化vv溶解度降低溶解度降低/ /黏度增加黏度增加 vv结晶能力消失结晶能力消失/ /生物活性丧失生物活性丧失 vv易被蛋白酶水解易被蛋白酶水解 vv实际应用实际应用vv防止蛋白制剂防止蛋白制剂/ /蛋白质药物的变性失活蛋白质药物的变性失活 vv使细菌蛋白质变性失活,消毒杀菌使细菌蛋白质变性失活,消毒杀菌 10 (五)蛋白质的分离和纯化(五)蛋白质的分离和纯化 根据分子大小根据分子大小 的纯化方法的纯化方法 透析和超
10、滤透析和超滤 超速离心超速离心 凝胶层析凝胶层析 利用大分子蛋白质性质利用大分子蛋白质性质 密度、形态、沉降系数不同密度、形态、沉降系数不同 利用溶解度利用溶解度 差别的纯化差别的纯化 方法方法 等电点沉淀等电点沉淀 盐析盐析 丙酮沉淀丙酮沉淀 利用蛋白质等电点不同利用蛋白质等电点不同 破坏水化层破坏水化层/ /电荷层电荷层 11 根据电荷不同根据电荷不同 的纯化方法的纯化方法 电泳电泳 l l SDS-PAGESDS-PAGE l l IEFIEF l l 双向电泳双向电泳 l l (SDS-PAGE/IEFSDS-PAGE/IEF ) l l 毛细管电泳毛细管电泳 蛋白质两性电离性质蛋白质
11、两性电离性质 离子交换层析离子交换层析 利用对配体的利用对配体的 生物亲和力的生物亲和力的 纯化方法纯化方法 亲和层析亲和层析配体配体抗体抗体/ /酶的底物酶的底物 HPLCHPLC (离子交换(离子交换/ /亲和亲和 层析层析/ /凝胶层析)凝胶层析) 高压液泵作用于流动相高压液泵作用于流动相 12 (六)蛋白质组和蛋白质组学(六)蛋白质组和蛋白质组学 蛋白质组蛋白质组 指某种细胞或组织中基因组所表达的指某种细胞或组织中基因组所表达的全部蛋白质全部蛋白质 不同环境不同环境/ /状态状态/ /发育阶段细胞发育阶段细胞蛋白水平蛋白水平的变化的变化 蛋白质组学蛋白质组学研究各种生物基因组在细胞中表
12、达的研究各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质全部蛋白质 的分子结构、功能及其相互作用的分子结构、功能及其相互作用的的新学科新学科 研究不同环境研究不同环境/ /状态状态/ /发育阶段发育阶段/ /不同组织的细胞中不同组织的细胞中 蛋白质分子的种类、结构和功能,蛋白质相互作用蛋白质分子的种类、结构和功能,蛋白质相互作用 发现新药发现新药 13 二、酶学二、酶学 (一)酶的一般特性(一)酶的一般特性 1 1、酶的化学本质和结构、酶的化学本质和结构 酶的基本概念酶的基本概念酶酶 vv生物催化剂生物催化剂 vv本质:蛋白质本质:蛋白质 vv底物:各类代谢物底物:各类代谢物 vv活细胞产生、具有催化功
13、能活细胞产生、具有催化功能 核酶核酶 vv生物催化剂生物催化剂 vv本质:本质:RNARNA vv底物:核酸底物:核酸 14 全酶、辅酶和辅基全酶、辅酶和辅基 vv全酶全酶vv酶蛋白酶蛋白-催化作用催化作用(特异性)(特异性) vv辅助因子辅助因子-金属离子金属离子 小分子有机物小分子有机物( (维生素维生素 ) ) vv辅基辅基vv非蛋白质部分非蛋白质部分-酶蛋白酶蛋白 共价键共价键 vv透析、超滤透析、超滤不能分离不能分离 vv辅酶辅酶vv非蛋白质部分非蛋白质部分-酶蛋白酶蛋白 非非共价键共价键 vv透析、超滤透析、超滤能能分离分离 15 酶的活性中心酶的活性中心酶分子上酶分子上必需基团必
14、需基团集中的特定空间结构区域集中的特定空间结构区域 功能单位功能单位1:1:与底物结合与底物结合 功能单位功能单位2:2:催化化学键的断裂和形成催化化学键的断裂和形成 ( (催化底物转变为产物催化底物转变为产物) ) vv特点特点vv辅酶的部分结构参与组成酶的活性中心辅酶的部分结构参与组成酶的活性中心 vv酶蛋白酶蛋白= =调节亚基调节亚基+ +催化亚基催化亚基 vv酶蛋白的三维结构是正常功能必需的酶蛋白的三维结构是正常功能必需的 16 酶酶-生物催化剂的特点生物催化剂的特点 vv容易失活(变性)容易失活(变性) vv具有极高效率具有极高效率 vv对底物专一性强对底物专一性强 vv酶活性可调节
15、酶活性可调节vv基因表达基因表达 vv激素激素 vv反馈抑制反馈抑制 vv抑制剂和激活剂抑制剂和激活剂 vv蛋白酶解激活蛋白酶解激活 vv可逆共价修饰可逆共价修饰 vv别构调节别构调节 17 转换数(转换数(KcatKcat) w w 酶的催化常数酶的催化常数 w w KcatKcat定义定义 w w 一定条件下一定条件下 转换转换 w w 每个酶分子每个酶分子 底物的分子数底物的分子数/ /每秒每秒 w w 一定条件下一定条件下 转换转换 w w 每每molmol酶分子酶分子 底物的底物的mol/mol/每秒每秒 2 2、转换数(、转换数(KcatKcat)和米氏常数()和米氏常数(KmKm
16、) 18 米氏常数(米氏常数(KmKm) w w KmKm定义定义 w w 当当v=1/2 Vv=1/2 V时,底物的浓度。时,底物的浓度。 w w 单位:单位:mol/Lmol/L w w KmKm意义意义 w w 酶的特征性常数酶的特征性常数 w w KmKm大小大小与与该酶对底物亲和力大小成反比该酶对底物亲和力大小成反比 KmKm大大,亲和力,亲和力小小,反应速度慢,反应速度慢 KmKm小小,亲和力,亲和力大大,反应速度快,反应速度快 uu酶对最适底物的酶对最适底物的KmKm值最小(亲和力最大值最小(亲和力最大 ) 19 Kcat /KmKcat /Km w w Kcat /KmKcat
17、 /Km w w 酶的催化效率的参数酶的催化效率的参数 w w 意义意义 w w Kcat /KmKcat /Km比值越大,酶催化效率越高比值越大,酶催化效率越高 w w Kcat /KmKcat /Km比值上限比值上限 = = 扩散速度常数扩散速度常数 (1010 8 8 -10-10 9 9 molmol-1 . -1 .L L . .s s -1-1 ) ) uu乙酰胆碱酶乙酰胆碱酶 20 3 3、酶的活力、酶的活力 w w 酶的活力酶的活力 w w 酶催化某一化学反应的能力酶催化某一化学反应的能力 w w 催化的化学反应速率表示酶活力的大小催化的化学反应速率表示酶活力的大小 w w 反
18、应速率大反应速率大, ,酶活力越高酶活力越高 w w 酶单位酶单位(U)(U) ( (酶活力单位酶活力单位 ) ) w w 一定条件下和一定时间内一定条件下和一定时间内, , 将一定量的底物转化成产物所需要的酶量将一定量的底物转化成产物所需要的酶量 uuU/g,U/mLU/g,U/mL w w 酶活力酶活力 国际单位(国际单位( IUIU) uu在最适反应条件(在最适反应条件(2525) uu每分钟内催化每分钟内催化1umol1umol底物转化为产物所需底物转化为产物所需 要的酶量要的酶量 uu1 IU=1 umol/min1 IU=1 umol/min 21 (二)酶的催化机制(二)酶的催化
19、机制 vv诱导契合假说诱导契合假说 (过渡态、活化(过渡态、活化 能和结合能)能和结合能) vv酶酶- -底物复合物的形成与诱导契合假说底物复合物的形成与诱导契合假说 vvE+S ES E+PE+S ES E+P (过渡态)(过渡态) vv邻近效应邻近效应 w w 酶蛋白酶蛋白+ +酶活性中心酶活性中心 反应基团在反应基团在 空间相互靠近空间相互靠近 vv一般酸碱催化一般酸碱催化 w w 同一种酶兼有酸、碱双重催化作用同一种酶兼有酸、碱双重催化作用 w w 在任何生理条件下顺利进行在任何生理条件下顺利进行 22 vv亲核催化亲核催化 (共价催化(共价催化 ) 和亲电催化和亲电催化 vv亲核催化
20、亲核催化酶的亲核基团与底物亲电中心酶的亲核基团与底物亲电中心 共价结合共价结合 uu 稳定过渡态稳定过渡态 uu 例:酶活性中心的例:酶活性中心的SerSer vv亲电催化亲电催化酶的亲电体与底物亲核中心结合酶的亲电体与底物亲核中心结合 uu 酶活性中心更敏感酶活性中心更敏感 uu 例:金属离子与底物结合例:金属离子与底物结合 vv静电效应静电效应vv酶活性中心中的带电荷的氨基酸侧链酶活性中心中的带电荷的氨基酸侧链/ /金属离子金属离子 uu 稳定过渡态稳定过渡态 23 (三)酶活性的调控(三)酶活性的调控 酶的活性调节酶的活性调节蛋白酶解激活蛋白酶解激活 (酶原与酶原的激活)(酶原与酶原的激
21、活) 酶的共价修饰调节酶的共价修饰调节 别构酶别构酶 代谢途径、代谢途径、限速酶限速酶 F G F G A B C D EA B C D E H L H L E E1 1 E E2 2 E E3 3 E E4 4 E E5 5 E E6 6 E E7 7 E E8 8 24 蛋白酶解激活(酶原的激活)蛋白酶解激活(酶原的激活) vv酶原酶原 vv在细胞内合成或刚分泌时在细胞内合成或刚分泌时 vv无催化活性的酶的前体无催化活性的酶的前体 vv例:消化酶例:消化酶/ /凝血因子凝血因子/ /补体系统补体系统/ /蛋白激素蛋白激素/ / 胶原蛋白胶原蛋白 vv酶原激酶原激 活活 vv过程:酶原过程:
22、酶原 酶酶 vv本质:酶的活性中心形成本质:酶的活性中心形成 vv特点特点vv不可逆共价修饰不可逆共价修饰 vv一般不需要消耗能量(一般不需要消耗能量(ATPATP) 25 vv别构酶别构酶vv酶的共价修饰调节酶的共价修饰调节 vv底物底物vv酶蛋白(四级结构)酶蛋白(四级结构)vv酶蛋白酶蛋白 vv作用物作用物vv别构剂别构剂 vv激活剂激活剂/ /抑制剂抑制剂 vv催化:催化:另一个酶另一个酶 vv修饰基团:修饰基团: 磷酸基团磷酸基团/ /乙酰基乙酰基 vv结合方式结合方式vv部位:部位:调节亚基调节亚基 vv非共价结合非共价结合 vv可逆地共价修饰可逆地共价修饰 vv构象变化构象变化v
23、v构象变化构象变化( (疏松疏松/ /紧密紧密 ) ) vv磷酸化或去磷酸化磷酸化或去磷酸化 vv乙酰化,去乙酰化乙酰化,去乙酰化 vv酶活性酶活性vv升高升高/ /降低降低vv升高升高/ /降低降低 vv动力学曲动力学曲 线线 vv呈呈S S形形 vv举例举例vv血红蛋白血红蛋白vvTyrTyr蛋白激酶蛋白激酶 26 信号分子和受体信号分子和受体 vv信号分子信号分子 |细胞间信息物质细胞间信息物质|第一信使第一信使 |细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质 w w 根据细胞分泌信息物质的方式分类根据细胞分泌信息物质的方式分类 神经递质神经递质 乙酰胆碱
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