分子生物学第六章基因的表达与调控上 (2).ppt
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1、 6 基因的表达与调控(上) 原核基因表达调控模式 v 原核生物细胞: v v 基因和蛋白质种类较少 v v 如大肠杆菌基因组约为4.60x106bp共有4288个 可读框。 v 据估计,一个细胞中总共含有107个蛋白质分 子,如果每个基因等同翻译的话,任何一个多肽应 有2500个拷贝。 v 但是,这些蛋白质并不是以相同拷贝数存在于 每个细胞中的,有些蛋白质的数目相当固定,另一 些则变化很大。 v 每个大肠杆菌细胞可以有约15000个核糖体,与 其结合的约50种核糖体蛋白,数量也是十分稳定的 。糖酵解体系的酶含量很大,其数目也极恒定。 v 如DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代谢过程 中十分必需
2、的酶或蛋白质,其合成速率不受 环境变化或代谢状态的影响,这一类蛋白质 被称为组成型(constitutive)合成蛋白质。 v 另一种类型的蛋白质的合成速率 明显地受环境的影响而改变,被称为 适应型或调节型(adaptive or regulated)蛋白质。 v 一般情况下,一个大肠杆菌细胞中只有 15个分子的-半乳糖苷酶,但若将细胞培养 在只含乳糖的培养基中,每细胞中这个酶的 量可高达几万个分子。 v 其他参与糖代谢的酶,氨基酸、核苷酸 合成系统的酶类,其合成速度和总量都随培 养条件的变化而改变。 v 细菌中所利用的大多数基本调控机制一般执行 如下规律: v 一个体系在需要时被打开,不需要
3、时被关闭。 是通过调节转录来建立的,也就是说在mRNA的合成 水平上调节。 v 实际上,当我们说一个系统处于关闭状态时, 也可能有本底水平的基因表达,常常是每世代每个 细胞只合成1或2个mRNA分子和极少量的蛋白质分子 。表示是基因表达量特别低,很难甚至无法检测。 61 原核基因表达调控总论 v 基因表达: v 从DNA到蛋白质的过程称为基因表达(gene expression) v 对这个过程的调节就称为基因表达调控(gene regulation或gene control)。 vv rRNArRNA、tRNAtRNA编码基因转录合成编码基因转录合成RNARNA的过程也属于的过程也属于 基因
4、表达。基因表达。 v 基因调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。 组成性表达(constitutive expression) 适应性表达(adaptive expression) 基因表达的方式 1、组成性表达: 指不大受环境变动而变化的一类基因表达。 某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达 ,通常被称为管家基因(housekeeping gene)。 2、适应性表达 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表 达。 v 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导 (induction),这类基因被称为可诱导的基因(inducible gene); v 相反,随环境条件变化而基因表达
5、水平降低的现象 称为阻遏(repression),相应的基因被称为可阻遏的基因 (repressible gene)。 基因表达的规律 时间性和空间性 1、时间特异性(temporal specificity) 按功能需要,某一特定基因的表达严格按特定 的时间顺序发生,称之为基因表达的时间特异性。 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特 异性(stage specificity)。 2、空间特异性(spatial specificity) 基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布 差异,实际上是由细胞在器官的分布决定的,所 以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue spe
6、cificity)。 在个体生长全过程,某种基因产物在个体按 不同组织空间顺序出现,称之为基因表达的空间 特异性。 基因表达调控的生物学意义 v 适应环境、维持生长和增殖(原核、真核) 维持个体发育与分化(真核) v基因表达调控主要表现: v (1)转录水平上的调控 v (transcriptional regulation); v (2)转录后水平上的调控 v (post transcriptional regulation) v转录后水平上的调控包括: v mRNA加工成熟水平上的调控 v (differential processing of RNA transcript); v 翻译水
7、平上的调控 v (differential translation of mRNA)。 v原核生物中 v 营养状况(nutritional status) v 环境因素(environmental factor) v 对基因表达起着举足轻重的影响。 v真核生物尤其是高等真核生物中 v 激素水平(hormone level) v 发育阶段(developmental stage) v 是基因表达调控的最主要手段,营养和 环境因素的影响力大为下降。 v原核: v 转录与翻译 过程几乎发生在同一 时间间隔内,转录与 翻译相偶联。 v真核生物: v 转录产物只有从 核内运转到核外,才 能被核糖体翻译成
8、蛋 白质。 6.1.1 原核基因调控机制的类型与特点 v原核生物的基因调控主要发生在转录水平上。 v根据调控机制的不同可分为: v 负转录调控(negative transcription regulation) v 正转录调控(positive transcription regulation) v 在负转录调控系统中,调节基因的产物是 阻遏蛋白(repressor),起着阻止结构基因转录 的作用。 v 根据其作用特征又可分为: v 负控诱导 v 负控阻遏 v 二大类。 v 在负控诱导系统中 ,阻遏蛋白不与效应物 (诱导物)结合时,结构 基因不转录; v 在负控阻遏系统中 ,阻遏蛋白与效应物
9、结 合时,结构基因不转录 。 v 阻遏蛋白作用的部 位是操纵区。 v 在正转录调控系统中,调节基因的产物 是激活蛋白(activator)。 v根据激活蛋白的作用性质分为: v 正控诱导系统 v 正控阻遏系统。 v 在正控诱导系统 中,效应物分子(诱导 物)的存在使激活蛋白 处于活性状态; v 在正控阻遏系统 中,效应物分子的存 在使激活蛋白处于非 活性状态。 转录水平上调控的其他形式 1. 因子的更换 在E.coli中,当细胞从基本的转录机制转 入各种特定基因表达时,需要不同的因子指 导RNA聚合酶与各种启动子结合。 参与大肠杆菌基因表达调控最常见的蛋白质是 因子。 v温度较高,诱导产生各种
10、热休克蛋白 由32参与构成的RNA聚合酶与热休克应答基因 启动子结合,诱导产生大量的热休克蛋白,适应环境 需要 枯草芽孢杆菌芽孢形成 有序的因子的替换,RNA聚合酶识别不同基因 的启动子,使芽孢形成有关的基因有序地表达 v 除参与氮代谢的 54以外,其它5种 因子在结构上具有同源 性,所以统称70家族 。 v 所有因子都含有 4个保守区,其中第2个 和第4个保守区参与结 合启动区DNA,第2个保 守区的另一部分还参与 双链DNA解开成单链的 过程。 v 大多数因子特异性结合DNA上的-35区和-10区,而54 因子识别并与DNA上的-24和-12区相结合。 v在与启动子结合的顺序上: v 70
11、类启动子在核心酶结合到DNA链上之后才能与启动子 区相结合 v 54则类似于真核生物的TATA区结合蛋白(TBP),可以在 无核心酶时独立结合到启动子上。 v 通过特殊代谢物调节的基因活性主 要有两大类: v 可诱导 v 可阻遏 v (1)可诱导调节: v 是指一些基因在特殊的代谢物或化合 物的作用下,由原来关闭的状态转变为工作 状态,即在某些物质的诱导下使基因活化。 v 大肠杆菌在含有葡萄糖的培养基中生长良好, 在只含乳糖的培养基中开始时生长不好,直到合成 了利用乳糖的一系列酶,具备了利用乳糖作为碳源 的能力才开始生长。 v 细菌在诱导物乳糖的诱导下开动了乳糖操纵子 ,表达它所编码的3个酶:
12、 v -半乳糖苷酶(使乳糖水解为半乳糖和葡萄糖) v -半乳糖苷透过酶(使乳糖进入细菌细胞内) v -半乳糖苷乙酰基转移酶(使-半乳糖第六位碳原子 乙酰化)。 v 在葡萄糖培养基中生长时,每个细胞只有几个 -半乳糖苷酶分子,但若转移到乳糖培养基中,几 分钟后,每个细菌细胞内可产生3000个酶分子。 v 因此,这类基因被称为可诱导基因 v 这类酶被称为诱导酶 v 这个生化过程被称为酶的诱导合成。 v (2)可阻遏调节: v 这类基因平时都是开启的,处在产生蛋 白质或酶的工作过程中,由于一些特殊代谢 物或化合物的积累而将其关闭,阻遏了基因 的表达。 v 大肠杆菌生活中必须有色氨酸,一般情况下, 色
13、氨酸操纵子是开启的。 v 如果在细菌培养基中加入色氨酸,使之能利用 培养基中的色氨酸来维持生活而不需要再费力去合 成,细菌往往能在2-3 min内完全关闭该操纵子。 v 某一代谢途径最终产物合成酶的基因可以 被这个产物本身所关闭。 v 这种基因被称为可阻遏基因 v 这些酶被称为可阻遏酶 v 这个现象被称为可阻遏现象 v 这些起阻遏作用的小分子被称为阻遏物。 v一般规律: v 可诱导的操纵子总是一些编码糖和氨基酸分解代谢 蛋白的基因,这些糖和氨基酸平时含量很少,细菌总是 利用更一般的能源物质葡萄糖的水解来提供能源, 因此,这些操纵子常常是关闭的。 v 一旦生存条件发生变化,如葡萄糖缺乏而必须利用
14、 乳糖作为能源时,就要打开这些基因。 v 可阻遏基因是一些合成各种细胞代谢过程中所 必须的小分子物质(如氨基酸、嘌呤和嘧啶等)的基 因,由于这类物质在生命过程中的重要地位,这些 基因总是打开着的。 v 只有当细菌生活环境中有充分供应时,才关闭 这些基因,停止其合成。 612 弱化子对基因活性的影响 v 大肠杆菌中色氨酸操纵子、苯丙氨酸操 纵子等的调节方式是通过弱化子调节的。 v 在这种调节方式中,起信号作用的是有特 殊负载的氨酰-tRNA的浓度,在色氨酸操纵子 中就是色氨酰-tRNA的浓度。 v 当操纵子被阻遏,RNA合成被终止时。 v 起终止转录信号作用的那一段核苷酸被称 为弱化子。 v 因
15、为核糖体在基因转录产物上的不同位置,决 定了RNA可以形成哪一种形式的二级结构、并由此 决定基因能否继续转录。 v 起调节作用的信号分子是细胞中某一氨基酸或 嘧啶的浓度,因此是转录调节中的微调整,只要稍 加变动就可影响整个体系的功能。 v 属于这种调节方式的有: v 大肠杆菌中的色氨酸操纵子 v 苯丙氨酸操纵子 v 苏氨酸操纵子 v 异亮氨酸操纵子 v 缬氨酸操纵子 v 沙门氏菌的组氨酸操纵子和亮氨酸操纵子 、嘧啶合成操纵子等。 613 降解物对基因活性的调节 v 操纵子学说的核心是使基因从表达抑制状态中 解脱出来进行转录,是从负调节的角度来考虑基因 表达调控的。 v 如何通过正调节以提高基因
16、的转录水平,使它 由原来的低水平表达变成高水平表达,这就是降解 物抑制作用的调节。 v 有葡萄糖存在的情况下,即使在细菌培养基中 加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物, 与其相对应的操纵子也不会启动,不会产生出代谢 这些糖的酶来,这种现象称为葡萄糖效应或称为降 解物抑制作用。 因为添加葡萄糖后,细菌所需要的能量便可从 葡萄糖得到满足,细菌无需开动一些不常用的基因 去利用那些稀有的糖类。 v 葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶活 性,减少cAMP的合成 v 与它相结合的蛋白质环腺苷酸受体蛋白 CRP(又称分解代谢物激活蛋白CAP)因找不到配 体而不能形成复合物。 v 降解物抑制作用是通过
17、提高转录强度来调节 基因表达的,是一种积极的调节方式。 614 细菌的应急反应 v 在所谓“正常”,也包括生活环境中缺少某一种或两种 能源,细菌能找到其他代用物,进行正常生活条件下的基因 表达调节。 v 可是,细菌有时会碰到紧急状况,比如氨基酸饥饿时, 就不是缺少一二种氨基酸,而是氨基酸的全面匮乏。为了紧 缩开支,渡过难关,细菌将会产生一个应急反应,包括生产 各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过 程均被停止。 v 实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五 磷酸(pppGpp)。 v 产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。 v 当氨基酸饥饿时,细胞中便存在大量
18、的不带氨 基酸的tRNA,这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶 ,使ppGpp大量合成,其浓度可增加10倍以上。 v ppGpp的出现会关闭许多基因,当然也会打开一 些合成氨基酸的基因,以应付这种紧急状况。 v 关于ppGpp的作用原理还不大清楚。 v 一般认为RNA聚合酶有不同的构象,这些构象可以 识别不同的启动子区,ppGpp与RNA聚合酶结合会使它的 某些构象稳定下来,从而改变了基因转录的效率。 v 也有人认为基因转录起始位点附近有一些保守序列 ,它们可能是ppGpp或有关调节蛋白的结合位点。当这 些序列与ppGpp结合后,就不能与RNA聚合酶相结合,使 基因被关闭。 v ppGpp与p
19、ppGpp的作用范围十分广泛,它们不是只 影响一个或几个操纵子,而是影响一大批,所以它们是 超级调控因子。 1、操纵子模型的提出 1961年,Monod和Jacob提出 获1965年诺贝尔生理学和医学奖 62 乳糖操纵子与负控诱导系统 Jacob and Monod 2、操纵子的定义 操纵子: 是基因表达的协调单位,由启动子、操纵基 因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组 成。 操纵基因受调节基因产物的控制。 v 大肠杆菌乳糖操纵子包括3个结构基因:Z、Y 和A,以及启动子、控制子(基因)和阻遏子等。 v 转录时,RNA聚合酶首先与启动区(promoter, P)结合,通过操纵区(oper
20、ator,O)向右转录。 v 转录从O区中间开始,按Z-Y-A方向进行,每次 转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因。 v 转录的调控是在启动区和操纵区进行的。 v3个结构基因各决定一种酶: v Z 编码-半乳糖苷酶: v Y 编码-半乳糖苷透过酶: v A 编码-半乳糖苷乙酰基转移酶: v -半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一性酶,除 能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外,还能水解其他-半乳 糖苷。 v -半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷(如 乳糖)透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内,所以, 如果用乳糖为大肠杆菌生长的惟一碳源和能源,这两种酶是 必需的。 v -半乳糖苷乙酰基转移酶的
21、作用是把乙酰辅酶A上的乙 酰基转移到-半乳糖苷上,形成乙酰半乳糖,它在乳糖的 利用中并非必需。 621 酶的诱导lac体系受调控的证据 v 在不含乳糖及-半乳糖苷的培养基中,lac+ 基因型大肠杆菌细胞内-半乳糖苷酶和透过酶的 浓度很低,每个细胞内大约只有1-2个酶分子。 v 但是,如果在培养基中加入乳糖,酶的浓度很 快达到细胞总蛋白量的6或7,每个细胞中可有 超过105个酶分子。 v 当有乳糖供应时,在无 葡萄糖培养基中生长的lac+ 细菌中将同时合成-半乳糖 苷酶和透过酶。 v 培养基中加入乳糖1- 2min后,编码-半乳糖苷酶 和透过酶的lac mRNA量就迅 速增加。 v 去掉乳糖后,
22、lac mRNA 量立即下降到几乎无法检测 到,表明乳糖确实能激发lac mRNA的合成。 v 研究诱导作用时很少使用乳糖,因为培养 基中的乳糖会被诱导合成的-半乳糖苷酶所 催化降解,从而使其浓度不断发生变化。 v v实验室里常常使用两种含硫的乳糖类似物: v 异丙基巯基半乳糖苷(IPTG) v 巯甲基半乳糖苷(TMG)。 v 另外,在酶活性分析中常用,发色底物O -硝基半乳糖苷(ONPG),它们都是高效诱导物 。因为它们都不是半乳糖苷酶的底物,所以 又称为安慰性诱导物(gratuitous inducer)。 v 如果某种物质能够促使细菌产生酶而本 身又不被分解,这种物质被称为安慰诱导物.
23、v 同位素实验证明,酶的合成不是由前体 转化而来的,而是加入诱导物后新合成的。 v 已经分离在有诱导物或没有诱导物的情况下都能产生lac mRNA的突变体,这种失去调节能力的突变体称为永久型突变 体,为分两类:I型和O型。 v I型:野生型为I+,突变型为I- O型:野生型为O+,突变型为Oc。 v I+ I-或O+ Oc后,Z、Y、A结构基因均表现为永久表达 ,所以I基因被称为调节基因(regulatory gene)。 v I基因是一个产生阻遏物的调节基因,其产物使体系关 闭。 I-突变体由于不能产生阻遏物,使细胞成为lac永久表 达型。 I- / I+局部二倍体由于带有一个正常阻遏物,使
24、细 胞中的lac仍然被抑制。 v 遗传学图谱分析指出, Oc突变位于I与Z之间, 所以,lac体系的4个基因的序列为IOZY。 v 通过这些观察,Jacob和Monod推断Oc突变代表 DNA链上的一个位点或一个非编码区域,而不是一个 基因,因为可编码的基因具有互补性,而Oc没有这 一特性。 v O决定相邻Z基因的产物是诱导型合成还是永久 型合成,O区域称为操纵基因。 622 操纵子模型及其影响因子 v 1961年Jacob和Monod发表lac操纵子负控诱导模式,建 立了乳糖操纵子的控制模型,其主要内容如下: v (1) Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子 所编码; v (2
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