分子诊断的临床应用.ppt
《分子诊断的临床应用.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子诊断的临床应用.ppt(102页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、分子诊断的临床应用 上海交通大学医学院 樊绮诗 教授 用分子生物学技术通过检测基因而达 到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物 学技术发展的最初阶段就有的设想。 上世纪70年代人们开始在实验室进行 研究,80年代以来,基因检测在许多国家 已成为常规检验项目,主要用于感染性和 遗传性疾病等的诊断。 n1953年Watson 和Crick 提出脱氧核糖核酸 的双螺旋结构模型。 n1990年人类基因组计划正式启动。 n2001年2月科学家宣布完成人类基因组的全 部序列图。 DNA重组技术(DNA recombination) 转基因技术(transgenic technique) 基因组学(genom
2、ics) 蛋白组学(proteomics) 基因治疗(genotherapy) 生物芯片(biochip)等技术 已应用到医学领域,对疾病机理的认识、疾 病的诊断、预防和治疗产生了深刻的影响。 n分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊 断,也能确定个体对疾病的易感性,判别 致病基因携带者并对疾病的分期、分型、 疗效监测和预后作出判断。 n分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组 成部分,成为一门新的学科。 Molecular diagnosis Molecular diagnostics 一、基因检测在感染性疾病 中的应用 SARS相关冠状病毒的分子诊断 n2003年4月,香港研究者Peiris等报
3、告了50 例 SARS病人的临床表现和病毒学研究结果。 n一种新的冠状病毒 (Coronavirus) 是SARS 的 致病原因。 (Lan cet, 2003, 361: 9365) 2003年4月,德国汉堡Bernhard-Nocht热带医 学研究所学者Drosten等用随机扩增技术,获得 一段长度为300bp的核苷酸序列。 根据这段序列,建立了检测新冠状病毒的常 规和实时定量PCR技术。 .org on April 10, 2003) n检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液 、血浆、粪便。 n检测方法 1. 逆转录-巢式PCR (Reverse-Nested PCR) 2.
4、逆转录-实时PCR (Reverse-Real time PCR) n有报道显示,在可能SARS病人中病毒的 检出率为100%。 n在疑似SARS病人中的检出率为23%。 n所有健康接触者中未检测到病毒。 另一项研究显示 检测病毒的3种方法(血清学检测、病 毒分离、PCR技术)中,PCR技术的检出率 最高。 讨 论 n疾病的早期即可获得阳性结果(早于血清转换 期)。 nSARS患者中的阳性率约为80%,对照中的阴性 率约为98%100%。 n现有的PCR方法有较高的特异性但灵敏度较差 ,阴性结果不能排除病毒感染。 讨 论 n痰液中病毒RNA浓度极高,说明病毒从呼吸道 排放是主要传播途径。 n血
5、清中检测到极低浓度的病毒RNA,提示病毒 复制不仅发生于呼吸道。 n病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA,说明粪 便可能也是一种传播途径。 n鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液, 提示不适合作为标本(有可能漏检)。 SARS相关冠状病毒基因检测 必须注意的问题 n必须在规范的基因扩增实验室中进行。 n应采取必要的质控规程,包括阳性对照和阴 性对照。 n阳性结果时必须对原始样本重复检验: 或者扩增另一个基因片段 或在另一个实验室对同一样本进行检测。 肝炎病毒基因的检测 临床价值主要体现在: 病情评估 血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关 ,病毒载量越高,肝组织炎症反应程度越重。 疗疗效
6、预测预测 治疗疗前病毒核酸载载量越高,疗疗效越差;载载量越 低,机体清除病毒的可能性越大。 预后判断 病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。 垂直传播途径感染者,预后较差。 反映肝细胞损害的其它指标正常,但病毒核酸 水平经常波动者更易发展为肝硬化。 病毒分型和耐药检测 各个编码区段存在着大量有意义的自然变异 或药物诱导的变异,并由此产生不同的变异株 ,从而导致 HBV感染的不同血清学和临床表现 。 检测HBV的变异株对了解疾病机制、药物耐受 和指导用药有一定的价值。 HPV基因的检测在预防宫颈 癌中的作用 n宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率在 女性恶性肿瘤中居第二位,每年约有50万左右新
7、 发病例。 n我国每年有新发发病例约约13.15万,占世界宫颈宫颈 癌新发发病例总总数的26%。 n持续的人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV) 感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因素 ,93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到HPV DNA。 n高危型HPV-16和HPV-18分别别占宫颈宫颈 癌的50%和 14%。高危型HPV的持续感染可使患宫颈癌的风险 增加250倍。 HPV DNA的检测方法 n实时定量PCR (Real time PCR) n核酸杂交捕获(Hybrid Capture,HC) nHC 可一次检测所有致癌的13种高危型HPV。 n敏感度:
8、对CIN 、和癌的检出率为 98%。 n阴性预期值:对高度鳞状上皮细胞病变或更高度 病变的阴性预期值99.9% n细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时, HPV基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。 n细胞学检查+HPV基因的检测是宫颈癌前病变和宫 颈癌筛查的最佳方法,成为预防宫颈癌的关键。 基因检测在监测移植物排 斥中的作用 关于多瘤病毒 n人类多瘤病毒中常见的3种病毒:BK、JC、SV40。 nBK病毒于1971年首次从肾脏移植受体的尿液中分离 出。病毒主要在宿主的细胞核内进行复制。 n在美国,10岁以上的正常人群中60%80%有BK 病毒感染史。 n感染的病毒多潜伏于肾小管上皮细胞和
9、尿道上 皮细胞中。 nBK病毒重新激活大部分是由于免疫机制缺陷或 大量使用免疫抑制剂后。 n肾脏移植术后大量使用免疫抑制剂,使BK病毒重 新激活,大量复制。 nBK病毒复制进一步发展,成为BK病毒感染的肾间 质性肾病(BKVAN)。 nBKVAN患者中60%70%会发生远期的肾脏移植失 败。 nBK病毒感染已经成为肾脏移植远期失败的 重要原因之一。 nBK病毒感染越来越受到关注。 n早期无临床症状,后期症状与肾移植排斥和药 物毒性反应相似,易引起误诊和漏诊。 nBK病毒感染和移植排斥治疗原则相反:BK病毒 感染需要降低免疫抑制剂量,而移植排斥则应加 大用量。 因此,建立有效的BK病毒检测和监测
10、体系 是十分必要的。 decoy细胞 nBK病毒感染的肾脏小管上皮细胞脱落至尿液。 n形态学检测敏感性较好,但特异性差。 n细胞形态在尿液中很容易破坏。 巴氏染色的decoy细胞 未经染色的decoy 细胞 BK病毒感染的检测 BK病毒的检测 n血、尿中BK病毒核酸定量检测 n尿液中decoy细胞检查 n尿沉渣涂片原位杂交 组织病理学检查(判断肾脏间质性肾病) 肾脏移植术后病人BK病毒检测的 研究 对象 n瑞金医院肾脏移植术后2个月3年的患者95例 n正常人标本60例 研究方法 n尿沉渣细胞形态学检测 n血、尿中BK 病毒DNA的定量检测 Decoy细胞形态学特征: 小管上皮细胞的细胞核明显增
11、大,多偏向 一侧,核浆比例明显增加;细胞边缘常常 出现毛玻璃样改变;胞浆有细小颗粒,较 均匀,呈果冻状;细胞核常较粗糙。 结 果 95例患者的尿沉渣形态学检查,35例 患者的尿沉渣中出现可疑的病毒感染肾小 管上皮细胞(decoy细胞)。 尿液中BK病毒核酸定量检测 n14例尿液中检测到BKV DNA,病毒载量为 41032109/ml,平均为5.6105/ml。 n发生病毒尿的中位时间为移植术后14个月。 血浆中BK病毒核酸检测 n14例病毒尿中,有5例同时出现病毒血症。 n核酸载量为2104/ml4.8106/ml,平均为 4.2104/ml。 阴性对照 n 6例病毒检测阳性的核酸标本进行序
12、列分析。 n 所测片段序列均为BK病毒的核酸序列 BK病毒核酸序列 核酸序列分析 n3例患者在临床上出现不明原因的发热、白细胞 降低、缓慢的肌酐升高等症状,有1例甚至出现了 尿道阻塞。 n临床上认为发生BKVAN的可能性较大,给予抗病 毒治疗。 病例1、2 治疗前: n尿液和血浆病毒核酸载量在104/ml105/ml n血肌酐分别为181mol/L和168mol/L 治疗后: n血浆和尿液中BK病毒已检测不出 n血肌酐降为160mol/L和129mol/L 病例3 治疗前 n尿液中BK病毒核酸载量为2109拷贝/ml n尿沉渣细胞中见到大量decoy细胞和炎性细胞 治疗后 n尿液中BK病毒核酸
13、载量降至105拷贝/ml n尿沉渣细胞中decoy细胞明显减少 治疗前 治疗10天后 治疗20天后 讨 论 n文献报道BK病毒的复制感染率为5%60%,本 研究中发生BK病毒复制的占14.7%。 n35例患者中发现decoy细胞,仅14例被证实存 在病毒核酸,提示形态学检查特异性差。 n肾脏移植的患者容易导致包括BK病毒在内的多 种病毒感染。 因此 n是否存在BK病毒感染,形态学仅作为筛查 实验。 n病毒核酸定量可有效地动态观察病毒核酸 的复制。 BK病毒核酸定量检测 n用于检测BK病毒是否复制 n为是否需要进行病理学检查提供依据 n监测疾病和评价治疗效果 n预防间质性肾病,防止移植远期失败
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子 诊断 临床 应用
链接地址:https://www.31doc.com/p-2982656.html