动物生化第九章核酸的生物学功能1.ppt
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1、第九章 核酸的生物学功 能 讲授内容 第一节 DNA的生物合成 第二节 RNA的生物合成 第三节 RNA催化活性的发现 第四节 蛋白质的生物合成 第五节 蛋白质的到位 第六节 中心法则 第七节 基因表达的调控 第八节 分子生物学技术 教学目标 v了解DNA复制的一般过程,以及原核细胞和真核细 胞DNA合成的异同 v了解PCR有选择扩增DNA的原理 v了解RNA合成涉及的起始、延伸和终止三个过程 v掌握核酶的概念 v掌握蛋白质合成的一般过程 v掌握乳糖操纵子模型 v了解几种分子生物学技术过程及原理 第一节 DNA的生物合成 一、 DNA的复制 vWatson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型
2、推测 DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂,两条链分 开 然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链 这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA, 另一条链是新合成的,这种复制方式为半保留复制 半 保 留 复 制 A=T G=C DNA合成的同位素示踪实验 1958,Meselson和Stahl 大肠杆菌 15NH4CI为唯一氮 源的培养液中生长若干代 被15N标记的大肠杆菌转入 14NH4CI为唯一氮源的培养液 中 完成第一代和第二代繁殖时 , 分离DNA,密度梯度超速离心 被15N标记的亲代双链DNA( 记作15N/15N)密度大,在下部 ;14N/14N密度小,在上部; 1
3、5N/14N在15N/15N和14N/14N之间 (一) DNA的半保留复制 (二)DNA复制开始于特定的 起点 v复制是从DNA分子上的特定部位开始的, 这一部位叫原点 (origin) v从原点开始同时向DNA链的两个方向进行 ,结果形成一个分叉,称为复制叉(fork) 原核生物与真核生物DNA合成区别 v大肠杆菌只有一 个复制原点,Q 形复制,速率 1700bp/s v高等生物有多个 复制点,速率只 有50bp/s DNADNA的复制总是由的复制总是由55向向3 3 方向进行方向进行 前导链前导链(leading strand)(leading strand) 以以3535方向的母链为方
4、向的母链为 模板,连续复制合成的模板,连续复制合成的 一条一条5353方向的链方向的链 随后链随后链 另一条母链另一条母链DNADNA是是 5353方向,它作为模板方向,它作为模板 时,复制合成许多条不时,复制合成许多条不 连续的连续的5353方向的短链方向的短链 (三) DNA复制中一股链是不连续合成 DNA复制的过程 (四)DNA复制相关的酶和蛋白 质 (1) DNA聚合酶 vDNA聚合酶I是一个模板指导酶 需要打开的DNA单链作为模板才能合成子链 此酶催化的底物必须是脱氧的核苷5-三磷酸(dATP、 dGTP、dTTP和dCTP) vDNA聚合酶 需要引物 DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加
5、于已存在的DNA或RNA链 的3-羟基上,缺少则不能合成 vDNA聚合酶还具有水解作用 DNA聚合酶I是一个35核酸外切酶,又是53核酸外切 酶。这两种酶活性对DNA的复制都是十分重要的 由DNA聚合酶催化的链延长反应 2引物酶 v复制合成先导链或随后链冈崎片段的引物 是一段RNA(5-10个核苷酸) v这段RNA由一种特异的RNA聚合酶合成, 此酶称为引物酶(Primerase)。 引物及引物酶的作用 v已知DNA聚合酶具有35的外切作用以校对复制中的错误核 苷酸。这就决定了它不能从头开始合成。 v因此先合成一段低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成,并以 核糖核苷酸来标记是“暂时”的。 v这
6、种高度精确的安排增加了DNA复制的复杂性,却保证了复制 的忠实性。 v已知复制的误差率仅为十亿分之一至百亿分之一,即复制十亿 到一百亿个碱基才可能出一个差错。 3.DNA连接酶 DNA聚合酶能将脱氧核苷酸加到引物 RNA链上并延长,但不能催化两条DNA单 链连接起来或把单条DNA链闭合起来。 二、DNA的损伤和修复 v保证DNA分子的完整性对于生物是至关重要的 v在几亿年进化的过程中产生了对复制过程中偶然 发生的错误,进行校正的高效“校正”系统及由于 客观因素造成的DNA损伤进行修复的系统。 (一) DNA的损伤 v某些化学、物理的因素可引起细胞DNA的损伤( 化学结构发生改变) 化学因素种类
7、繁多,机制也很复杂; 物理因素中紫外线的作用机制研究得比较清楚。例如 形成胸腺嘧啶二聚体。 此外,DNA的损伤还有碱基可能改变或丢失、骨架中 的磷酸二酯键可能断裂,螺旋链可能形成交联等。 胸腺嘧啶二聚体 v紫外线引起DNA分子中同一条链上相邻的两个嘧啶核苷酸 以共价键连接生成环丁烷结构,即嘧啶二聚体。 v最易见的是胸腺嘧啶二聚体。此种二聚体不能容纳在双螺 旋结构中,它不能与互补链上的腺嘌呤形成氢键配对,影 响DNA的复制和基因表达。 (二) 损伤修复系统 v修复保护DNA的正常功能是非常重要的 v不论物理因素或化学因素所造成的损伤,只要DNA结构 发生改变,就能被修复酶识别,而把不正常的部分切
8、除 光诱导的修复(光修复) 不依赖光的修复(暗修复) v在高等动物体内暗修复代替了光修复。 光修复 v光修复也称光复活 它是由可见光(300-400nm)激活光复活酶,该酶能 分解胸腺嘧啶二聚体。 已从细菌和动物的细胞中分裂出一种光复活酶。 哺乳动物和人体内缺乏此酶。 暗修复 暗修复通过三种不同的机理来完成修复 : 1切除修复(excison repair) 2重组修复(recombinational repair ) 3SOS修复(SOS repair) 切 除 修 复 2重组修复 v重组修复是一种复制后 修复。 这种修复中含嘧啶二 聚体的DNA片段仍可 进行复制,但子链中 在损伤的对应部位
9、出 现缺口。 复制后通过分子内重 组或称为姐妹链交换 (sister-strand exchange),从完 整的亲代链上把相应 碱基顺序的片段移至 子代链缺口处,使之 成为完整的分子。 亲链上的缺口由聚合 酶I和连接酶填补完整 ,这就称为重组修复 。 重组修复的结 果 v在重组修复过程中亲代链上的嘧啶二聚体并未消除 ,因此在进行第二次复制时子代链中仍会出现缺口 ,还需通过重组修复来弥补。 v但随着复制的不断进行,代数增多之后,虽然亲代 链中的嘧啶二聚体仍然存在,而损伤的这一条DNA 链却逐渐被稀释,最后对正常生理过程没有影响, 损伤也就得到了修复。 3SOS修复 v这种修复是允许子链DNA复
10、制合成时越过亲链上受损伤 的片段而不形成缺口,称为旁路系统(bypass system )。 v这种修复以牺牲复制的忠实性为代价。 例如修复嘧啶二聚体时,SOS系统被激活后,就沿复制叉前进 合成子链,但在损伤对应部位随机放上两个腺嘌呤或其它错误核 苷酸,子链虽合成但可能含有碱基错误。 vSOS修复的详细机理还不十分清楚。 三、RNA指导下的DNA合成 v20世纪70年代从一些含RNA的肿瘤病毒如鸟类成髓细 胞白血病病毒和劳氏肉瘤病毒中分离到一种独特的 RNA指导的RNA聚合酶 v由于它以RNA为模板合成DNA,故此称为反转录酶( reverse transcriptase) 反转录 酶 v反转
11、录酶以病毒RNA为模板,在引物参与下以四种dNTP为 底物,按53方向催化合成一条与模板RNA互补的RNA- DNA杂交链,其中的DNA链称为互补DNA链(cDNA)。 然后再以新合成的RNA链为模板,合成另一条互补的DNA 链,形成双链的DNA分子。 v新合成的双链DNA分子可以进入宿主细胞核,并整合到宿 主的DNA中,随宿主DNA一起复制传递给子代细胞。 v在某些条件下此潜伏的DNA可以活跃起来转录出病毒RNA 而使病毒繁殖。在另外一些条件下它也可以引起宿主细胞发 生癌变。 逆转录病毒的生活周期 四、多聚酶链式反应(PCR) 多聚酶链式反应(PCR, Polymerase chain re
12、action),是20世 纪80年代末发展起来的一种快速的DNA特 定片段体外合成扩增的方法。 PCR反应的步骤 在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,人工合成的 两个DNA引物,四种脱氧单核苷酸(dNTP),一种耐热的多聚酶和 Mg2+。 将上述溶液加热,使模板DNA在高温下(如95)变性,双链解开为 两条单链; 然后降低反应温度,使两条引物在低温下(37)分别与两条模板互 补退火,形成局部双链; 再升高反应温度至中温(72),此时多聚酶以dNTP为原料,以两 引物为复制的起点,在两条模板上合成新的DNA子链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段 。
13、PCR反应的结果 v以三次改变温度为一个循环,每一次循环就使欲扩增的 DNA区段的拷贝数放大一倍 v即第一次循环,每条模板双链DNA变为2条;第二次循环 ,则变为4条;第三次循环,变成8条以几何级数扩增 下去。 v一般样品经30次循环最终使特定DNA片段放大了数百万 倍。 PCR的特点 (1)对DNA模板要求不高,纯度要求不严,用量很低, DNA分子量的长度仅为几百个bp,只要含有未损伤的需要 扩增的片段即可。 (2)引物设计十分重要,它决定了PCR扩增片段的大小及特 异性。引物的设计是按需要及引物设计原则进行的。现在 已有DNA合成仪,设计好的引物能很快合成。 (3) 需要一个耐热的DNA聚
14、合酶。发现了TaqDNA聚合酶 ,PCR才进入实用阶段。PCR技术现已成为分子生物学、 医学、生物工程、法医学及考古学等领域不可缺少的工具 。 PCR技术的应用 PCR技术可以广泛应用于科研和实 际检测中,用于DNA研究、序列分析、 测定基因表达,从cDNA可放大特定克 隆、构建基因图、进化分析、生物证据 分析和医学研究与临床检验等。 五、DNA核苷酸顺序测定 DNA顺序测定技术有A.Maxam和 W.Gilbert提出的化学裂解法和1978年 F.Sanger提出的双脱氧核苷酸末端终 止法。以Sanger法最适用。 Sanger法的程序 vSanger法最突出的特点是在PCR反应中加入一种2
15、,3- 二脱氧核苷三磷酸(ddNTP),整个测定的程序如下: 将被测DNA制成单链模板。分别加入4个反应管中。并在每个管中 加入引物、DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种为32P标记)。然后 在4个管中分别加入ddTTP、ddCTP、ddGTP和ddATP。然后进 行保温反应。 由于双脱氧的ddNTP比正常的dNTP少了3-羟基,当它在DNA聚 合酶作用下掺入到正在延伸的DNA链时,因ddNTP不含3-羟基, 于是就阻止了其它dNTP的继续掺入,起了特异性终止剂的作用。 2,3-二脱氧核苷三磷酸结构图 Sanger法的结果分析 v反应结束后在4个管中分别形成一些全部具有相同5-引物 端、和分别
16、以ddT、ddC、ddG、ddA 残基为3-端结尾的 一系列长短不一的混合物。 v每种混合物经变性聚丙烯酰胺电泳分离及放射自显影,可 见4种混合物形成不同的电泳迁移条带。每一条带都代表 着一段以ddNTP终止的片段。 v只要按照电泳条带出现的先后次序即可读出被测DNA的顺 序。 第二节 RNA的生物合成 一、转 录 v整个生物体所有的遗传信息,都编码在每个细胞的 DNA分子中。 vDNA是通过转录(transcription),将遗传信息 转移到RNA分子上。 v转录就是以DNA为模板合成RNA的过程。 (一) DNA的大小与基因 v在整个DNA的分子上分布着许多特殊的片段。在这些片 段中有些
17、是为一种或几种蛋白质的全部氨基酸编码的核 苷酸顺序,称为基因(gene),也称为顺反子或多顺反 子。 v通常也把这些编码蛋白质的基因片段称为结构基因。在 DNA分子上还有些片段是为rRNA和tRNA编码的核苷酸 ,这些片段有时也称为基因。 v有些DNA片段,不编码基因而是一些不被转录的调控区 ,它们具有主宰基因转录和表达的功能,是基因不可缺 少的部分。 重复基因 vDNA中有些基因是重复的,称为重复基因。 原核生物中的重复基因数较少,真核生物中重复基因 则很丰富 如酵母的tRNA基因为每一种不同的tRNA编码的基因 平均达10个重复基因 v这种多重复基因的现象,是为适应细胞的分裂 和增殖的需要
18、。 基因重叠 vDNA分子中的基因的组合也很不相同 v在一些病毒中存在基因重叠的现象,如大肠杆菌噬菌体 174DNA序列中基因排列 。 不连续基因 v真核生物的许多基因是不连续的,即一个完整的基因被 一个或更多个插入的片段所间隔。 v把这些插入而不编码的序列称为内含子(intron),把 被间隔的编码蛋白质的基因部分称为外显子(exno)。 v转录出来的所有RNA都必须经过加工,除去其中的内含 子并经复杂的修饰才能成为成熟的各种RNA,其中的 mRNA才能成为合成蛋白质的模板。 (二)双链DNA中仅有一段被转录 v基因中仅一股链被转录。现在把被转录的一股 链称为模板链,另一股链称为编码链。 v
19、mRNA与模板链是互补的。mRNA的核苷酸顺 序则与编码链完全相同,只是其中以U代替了T 。因此,mRNA的遗传信息与编码链相同,代 表了基因的编码顺序。 (三)RNA聚合酶 v基因的转录是由RNA聚合酶(RNA polymerase)催化 。 RNA聚合酶催化底物合成时是形成磷酸二酯键。 合成的方向是53:即RNA聚合酶是沿着模板链的3 5方向 移动。 vRNA聚合酶的条件 模板,双链DNA或单链DNA均可作模板。 活化的底物,需要4种三磷酸的核苷酸:ATP,GTP、UTP及 CTP为反应底物。 二价金属离子,主要是Mg2+和Mn2+。 RNA聚合酶的结构组成 v大肠杆菌的RNA聚合酶是一个
20、非常大的(450KD)极其复杂的酶 分子。它由4种亚基组成。 整个酶的亚基组成是2,称为全酶。 没有亚基的RNA聚合酶称为核心酶(2)。 vRNA聚合酶中各亚基的作用 亚基激活RNA聚合酶使之识别转录起始点的序列,并参与解开DNA 双链,找到模板链。当转录开始合成RNA链后,亚基就从全酶中解离 下来。解离下来的亚基可与另一核心酶连接,开始另一轮的转录。 核心酶继续对DNA模板转录。 全酶的作用是识别起始,而核心酶的作用是延长及辨认转录终止。 (四)DNA模板上的启动子 v概念 转录起始于RNA聚合酶结合在被转录的DNA区段上。结合的特定 部位称为启动子(promoter)。 它是20至200个
21、碱基的特定顺序。 v习惯上将+1以下的转录方向称“下游”,-1以上称“上游”, 启动子在上游区。 v现在发现原核生物的启动子顺序中存在两个共同的顺序, 即-10顺序,也称为Pribnow顺序(pribnow box)和-35 顺序 。 启动子中不同顺序的作用 v-10顺序 -10的基本顺序是TATAATG。 -10顺序被看作是双螺旋打开形成开放启动复合物的 区域。 v-35顺序 典型的情况下含有9个碱基,被认为是酶结合的起始 部位。 启动子常以单位时间内合成RNA分子数的多少分为 强启动子和弱启动子。据认为强弱之间的区别就存在 于-35的结构中。 启动子处的反应 v聚合酶含有两个核苷酸结合位点
22、,称为起始部位和 延伸部位。起始部位结合三磷酸嘌呤核苷酸ATP或 GTP。 v转录与复制不同,不需要引物,因而合成的RNA 第一个核苷酸常常是pppA或pppG。 (五)延长在转录鼓泡上进 行 v转录泡是一个含有核心酶、DNA和新生RNA的区域,在这个区域 里含有一段解链的DNA“泡”,所以称为转录泡(transcription bubble)。 v在“泡”里新合成的RNA与模板DNA链形成一杂交的双螺旋。此段 双螺旋长约12bp,相当于A型DNA螺旋的一转。 v在“泡”里核心酶始终与DNA的另一链(编码链)结合,使DNA中 约有17个bp被解开。延长速率大约是每秒钟50个核苷酸,转录鼓 泡移
23、动170nm的距离。 RNA-DNA杂交链的长度 v在RNA聚合酶沿着DNA模板移 动的整个过程中形成的RNA- DNA杂交链的长度及DNA未解 开的区域长度均保持不变。 v杂交双链12bp的长度恰好短于 双螺旋完整的一转,当形成完整 的一转前,RNA因弯曲很厉害 即离开了DNA模板,防止了 RNA 5-末端与DNA相互缠绕打 结。 转录的错误频率 vRNA聚合酶没有核酸外切酶活性,不能对进入RNA链的 核苷酸进行校正,所以转录的错误频率是每104或105中 有一个错误,是DNA复制中错误的105倍。 v这种准确性虽很低,但由于RNA的转录产物很多,极少 数有缺陷的转录产物大概不会产生有害的影
24、响。 (六)转录终止 v转录有终止点,转录终止 出现在DNA分子内特定的 碱基顺序上。 v细菌及病毒DNA的终止顺 序分析证明,它们有明显 的特点 。 富含GC,转录产物极易形 成二重对称性( dyadsymmetry)结构, 紧接GC之后有一串A 。 按此模板转录出来的RNA 极易自身互补,形成发夹 状结构 新生的RNA链却以几个U 残基而结束。当RNA聚合 酶遇到这种结构特点时就 会停止下来。 二、RNA转录后的加工成熟 1.原核生物的mRNA成熟过程 2.原核生物的tRNA成熟过程 3.原核生物的rRNA成熟过程 1. 原核生物的mRNA成熟过程 v原核生物的mRNA通常不用修饰,因生成
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