南农生物分离工程生物分离3 (2).ppt
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1、沉淀法 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出 的过程。 沉淀法操作简便,成本低廉,是分离纯化生 物大分子,特别是制备蛋白质和酶时最常用 的方法。 通过沉淀,将目的生物大分子转入固相沉淀 或留在液相,而与杂质得到初步的分离。 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法: 中性盐沉淀(盐析法):多用于各种蛋白质 和酶的分离纯化。 有机溶剂沉淀:多用于蛋白质和酶、多糖、 核酸以及生物小分子的分离纯化。 选择性沉淀(热变性沉淀和酸碱变性沉淀) :多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易 变性的杂蛋白。 等电点沉淀:用于氨基酸、蛋白质及其他 两性物质的沉淀,但此法单独应用较少, 多与其他方法结合使用。 有机
2、聚合物沉淀: 是发展较快的一种新 方法,主要使用PEG聚乙二醇( Polyethyene glycol)作为沉淀剂。 中性盐沉淀(盐析法) 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析 出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外 ,多肽、多糖和核酸等也可以用盐析法进行 沉淀分离。 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域,已 有八十多年的历史。 盐析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态 : 两性电解质,由于静电力的作用,分子间相互 排斥,形成稳定的分散系 蛋白质周围形成水化膜,保护了蛋白质粒子, 避免了相互碰撞 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质 水化层
3、+ + + + + + + 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒 酸碱 酸碱 酸碱 脱水作用脱水作用脱水作用 蛋白质的聚沉 蛋 白 质 胶 体 溶 液 沉 淀 作 用 示 意 图 A、设备简单、成本低、放大容易,产物浓度越高 沉淀越有利,收率越高; B、原料液体积很快地减小1050倍,从而简化生 产工艺、降低生产费用; C、对许多生物活性物质具有稳定作用 D、操作简单、安全。 优点 缺点: A、沉淀物可聚集有多种物质,如大量盐类和溶剂 ,所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低; B、过滤较困难 盐析法 Cohnx经验公式 式中, S为蛋白质的溶解度(g/L);I 为离子强度; 值
4、为蛋白质在纯水中(I=0时)的假 想溶解度对数值,是pH值和温度 的函数,在蛋白质pI时最小; Ks为盐析常数,与蛋白、盐种类有关 ,与温度和pH值无关。 例题: 牛血清白蛋白的盐析:由实验测得牛血清 白蛋白在2.5 mol/L和3.5 mol/L (NH4)2SO4溶液中的溶解度分别为12g/L和 0.006g/L,则它在3.0 mol/L (NH4)2SO4 溶液中的溶解度为多少? 解:先由实验结果求得盐析常数: Lg蛋白质的溶解度=9.329-3.3(NH4)2SO4 因此,在3.0 mol/L (NH4)2SO4溶液中, 蛋白质的溶解度=0.27g/L 盐析法 方法: A、 “Ks”分
5、级盐析法: 在一定pH值及温度下 ,改变盐浓度(即I )达到沉淀的目的。 B、“”分级盐析法:在 一定I下,改变溶液 的pH值及温度达到沉 淀的目的。 C、应用:一般的初步 分离用第一种方法, 进一步纯化时用第二 种方法。 常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4 , 溶解度大:尤其是在低温时仍有相当高的溶解度 。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定,因而 盐析操作也常在低温下(04)进行。 几种盐在不同温度下的溶解度(克/100毫升水) 0 20 80 100 (NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.
6、6 7.8 93.8 101 分离效果好:有的提取液加入适量硫酸铵 盐析,一步就可以除去75的杂蛋白, 纯度提高了四倍。 不易引起变性,有稳定酶与蛋白质结构的 作用。有的酶或蛋白质用23mol/L浓 度 的(NH4)2SO4保存可达数年之久。 价格便宜。 (NH4)2SO4缺点: 水解后溶液pH降低,在高 pH下产氨,腐蚀 性强,有异味,终产物必须除尽。 次常用Na2SO4 缺点:在40以下溶解度较低,主要用于热 稳定蛋白。 盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉 ,在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入,避免局部 硫酸铵浓度过大而造成蛋白质沉淀。 盐析后要在冰浴中放置一段时间,待沉
7、淀完全后 再离心与过滤。 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离,高浓 度硫酸铵常用过滤方法。 加固体(工业)、饱和溶液 (小规模) 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可查出。 25 饱和浓度4.1mol/l(767g/l) 100%饱和度 X=G(P2-P1)/(1-AP2) X:g/L G: 0 515 20 513 A: 0 0.27 20 0.29 P1、P2:初始、最终饱和度% 饱和溶液体积 Va=Vo(P2-P1)/(1-P2) Vo:蛋白溶液原始体积L l 不同的蛋白质分子,由于其分子表面的极 性基团的种类、数目以及排布的不同,其水 化层厚度不同,故盐析所需要的盐浓度也不 一样,因此调节
8、盐浓度,可以使不同的蛋白 质分别沉淀。如: 血清 球蛋白 清蛋白 (NH4)2SO4 50%饱和度 饱和 析出 析出 分段盐析 盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶,没有文献数据可 以借鉴,则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。 蛋白质量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫酸铵饱和度 影响因素 无机盐种类 In 1888,Hofmeister对一系 列盐沉淀蛋白质的能力进 行了测定研究。 阴离子排序为:柠檬酸根3- 酒石酸根3- F- IO-3 H2PO-4 SO-4 CH3COO- Cl- ClO-3 Br- NO-3 ClO-4 I- C
9、NS-; 对阳离子排序为: Th4+ Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+ 无机盐加入量 配制一系列不同硫酸铵饱和度的蛋白质溶液,离 心除蛋白,测定上清液蛋白浓度。 无机盐添加方式 连续(需盐量多) 蛋白质浓度 高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉 淀,若蛋白质浓度过高,易产生各种蛋白 质的共沉淀作用。 低浓度的蛋白质,共沉淀作用小,但回收 率降低。 较适中的蛋白质浓度是2.53.0,相 当于25 mg/mL30mg/mL。 要将盐析分布曲线重叠的两个蛋白质分级沉淀: 稀释后可能分级。 温度T 在低离子强度溶液或纯水 中蛋白质的溶解度大多
10、数 还是随温度升高而增加。 高盐常相反 一般情况下,可在室温下 进行。 但对于某些对温度敏感的 酶,要求在04下操 作,以避免活力丧失。 溶液pH pH影响Cohnx方程中的值 。 在等电点处溶解度小 ,pH值常选在该蛋白 质的等电点附近。 如从酵母中提取细胞色素C: 离子交换后,洗脱液加85%(NH4)2SO4 , pH5.0-5.5,产生杂蛋白沉淀,除杂蛋白, 上清液调pH4.8-5.1,产生细胞色素C沉淀。 盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象,即 仍有活性。 蛋白质用盐析方法沉淀分离后,还需要 脱盐才能进一步精提纯。脱盐常用透析 法。 透析是将含有小分子杂质 的蛋白质溶液装在半透膜( 玻璃纸
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