南农生物技术制药第六章基因治疗.ppt
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1、1 人基因组计划和基因治疗 2 人类历史上三大工程 阿波罗登月计划(19611972) 曼哈顿原子弹计划(19421945) 人类基因组计划(19902003) 也反映了生命科学后来居上。 曼哈顿原子弹计划(19421945) 美国陆军部于1942年6月开 始实施的利用核裂变反应来研制 原子弹的计划。为了先于纳粹德 国制造出原子弹,该工程集中了 当时西方国家(除纳粹德国外)最 优秀的核科学家,动员了10万多 人参加这一工程,历时3年,耗 资20亿美元,于1945年7月16日 成功地进行了世界上第一次核爆 炸,并按计划制造出两颗实用的 原子弹。 阿波罗登月计划(19611972) 美国于20世纪
2、60、70年代 组织实施的载人登月工程,它是 世界航天史上具有划时代意义的 一项成就。工程开始于1961年5 月,至1972年12月第6次登月成 功结束,历时约11年,耗资255 亿美元。在工程高峰时期,参加 工程的有2万家企业、200多所 大学和80多个科研机构,总人数 超过30万人。 人类基因组计划(19902003) 1986年,著名生物学家、诺贝尔奖获得者 雷纳托.杜尔贝科(Renato Dulbecco)在 Science杂志上率先提出“人类基因组计划”。 1990年10月,美国政府正式启动人类基因 组计划,后有德、日、英、法、中等6个国家 的科学家先后正式加入,有16个实验室及11
3、00 名生物科学家、计算机专家和技术人员参与。 2003年4月14日,六国科学家宣布人类基 因组序列图绘制成功,人类基因组计划的所有 目标全部实现。已完成的序列图覆盖人类基因 组所含基因区域的,精确率达到99.9 ,这一进度比原计划提前两年多。至此,人类 基因组计划共耗资27亿美元,比原先预计的30 亿美元明显节省。 人类基因组计划的启动 1985年,美国能源部(Department of Energy, DOE)提出,要将共包含约 3109碱基对的人类基因组全部碱基序列 分析清楚; 1986年,美国宣布启动“人类基因组计划 (Human Genome Project, HGP)”。 l人类基
4、因组包括分布于人46条染色体30 亿核苷酸的30,000-35,000个基因。 l人类基因组计划最终目的是测定基因组 的全部序列,弄清整个基因组的结构、 功能及其表达产物,彻底了解人类生命 活动本质。 人类基因组计划要测定的是人体人类基因组计划要测定的是人体2323对染色体中的所有对染色体中的所有 DNADNA的序列,它由的序列,它由31.64731.647亿个碱基对组成,共有亿个碱基对组成,共有3 3万至万至 3.53.5万个基因。换句话说,生命天书是由万个基因。换句话说,生命天书是由3030多亿个字写多亿个字写 成的,如果将这成的,如果将这3030多亿字排版到一张报纸上,那么大约多亿字排版
5、到一张报纸上,那么大约 需要需要2020万页纸才能排完这部巨著。万页纸才能排完这部巨著。 由此可以想见,读由此可以想见,读 取这部巨著所要耗费的时间将是如何的惊人。取这部巨著所要耗费的时间将是如何的惊人。 解读生命的“天书”-人类基因组计划 6国科学家组成的国家人类 基因组中心主要研究比例 美国:WASHMIT等7家研究中心,贡献率为54。 英国:SANGER一家研究中心,贡献率为33。 日本:RIKEN等两家研究中心,贡献率为7。 法国:GENOSCOPE研究中心,贡献率为2.8。 德国:IMB等3家研究中心,贡献率为2.2。 中国:北京华大研究中心、国家南北方基因研究 中心等三家,贡献率为
6、1。 中国人类基因组计划 1993年,中国人类基因组计划(CHGP) 启动,首先开展了“中华民族基因组中若 干位点基因结构的研究”。 1997年,我国启动了“重大疾病相关基因 的定位、克隆、结构与功能研究”项目。 之后,在上海和北京相继成立了国家人 类基因组南、北两个中心。 中国人类基因组计划研究成果 1. 1%测序任务, 第三条染色体3000万bp 2. 精确度99.99% 3. 发现142个基因, 其中80个为预测基因 人类基因组计划1%测序中国实验室 人类基因组计划的发展 1999年12月1日,首条人类染色体完成测序 ,人类第22号染色体DNA全序列测定宣 布完成。 2000年4月6日,
7、美国Celera遗传信息公司 宣布,该公司已破译出一名实验者的完 整遗传密码。 2000年5月,科学家聚集美国冷泉港,宣 布人类基因组草图的完成。 二000年六月二十六日克林顿宣布 人类基因组草图绘制完成 人类基因组计划首席科学家、 美国国家人类基因组研究所所长 弗朗西斯柯林斯在介绍情况。 人类基因组草图基本信息 由31.65亿bp组成 含33.5万基因 与蛋白质合成有关 的基因占2% 人类基因组人类蛋白质 61%与果蝇同源 43%与线虫同源 46%与酵母同源 人类基因研究的最新发现 v 人类基因总数在33.5万个之间,低于原来估计数目的 一半。这说明人类在使用基因上比其它物种更为高效。 v
8、基因组中存在着基因密度较高的“热点”区域和大片不携 带人类基因的“荒漠”区域。 v 大约1/3以上基因组包含重复序列,这些重复序列的作用 有待进一步研究。 v 所有人都具有99.99%的相同基因,而且不同人种的人比 同一人种的人在基因上更为相似,任何两个不同个体之 间大约每1000个核苷酸序列中会有一个不同,这称为单 核苷酸多态性(SNP),每个人都有自己的一套SNP,它对 “个性”起着决定的作用。 人类基因组研究能明白什么?人类基因组研究能明白什么? 搞清楚人类基因组序列后,可以通过各搞清楚人类基因组序列后,可以通过各 种分析手段将所编码的基因进行定位,就好种分析手段将所编码的基因进行定位,
9、就好 象将一架钢琴的象将一架钢琴的8888个键的音频搞清楚(或者个键的音频搞清楚(或者 说要将基因的说要将基因的元素周期表元素周期表定出来)。但对这定出来)。但对这 架钢琴是如何演奏出动听的乐曲架钢琴是如何演奏出动听的乐曲, , 不能提供不能提供 什么信息。什么信息。 同一种基因组可以有同一种基因组可以有 不同的演奏法不同的演奏法 21 生物技术与人基因组 计划的研究策略 22 测序策略:鸟枪法 23 测序组装 过程 8个随机测读片 段(10-20bp) 计算机进行组装 最后得到长 72bp长片段 24 Sequencing a genomic by using an overlapping
10、clone map 测序构建重叠群与组装 25 构建亚克隆库 26 末端配对测序 27 ideoxynucleotides (双脱氧核苷酸) ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与 复制,一旦链入DNA 中,其后就不能再继 续连接。 反应体系中dNTPs的浓 度远高于ddNTPs(一般 1:34) 测序方法:双脱氧法 28 基因组学家们巧妙地将 在制造业中使用的机器 人扩大化利用以增加测 序的通量,提高可靠性 和精确性 29 亚克隆测序的创新 放射性标记 平板凝胶电泳 两大革新: 荧光标记 毛细管电泳 大大提高了测序的效率 1.4个链终止反应可以在同一 个体系中进行也可以在同一个 泳
11、道中进行电泳 2.实时地自动检测 1.无需费时的灌胶点样工序 2.同一个毛细管可以被多次 使用 3.整个测序反应都是机器人 操作进行 革新点 30 早期的DNA测序分成4个独立的 反应进行延长后的DNA片段被 放射性同位素标记(主要是 32P和35S)曝于X射线下进行 DNA的检测 不同颜色荧光标记的 ddNTPs半自动化的测序机 器进行DNA的测序 31 人基因组测序完成 32 33 人類基因體計畫 34 人类基因组 计划的意义及影响 人类基因组计划的意义 一、获得人类全部基因序列将有助于人类认识许 多遗传疾病以及癌症等疾病的致病机理,为 分子诊断、基因治疗等新方法提供理论依据 。 二、破译
12、生命密码的人类基因组计划有助于人们 对基因的表达调控有更深入的了解。 三、人类基因组图谱对揭示人类发展、进化的历 史具有重要意义。 人类基因组研究与未来药学 基因组药物学 通过研究个体对包括药物在 内的外界化学物质(有毒外源物)反应的遗传 多样性和差异性,达到科学合理用药的目的 。 发现和开发新的蛋白质和多肽类药物。 提供大量药物作用新的靶点,供新药的筛选 、研究用。 人类基因组研究的应用 人类基因组计划不仅可以揭示生命活动的奥秘,而且人类6千多种单基因遗传 性疾病和多基因易感性疾病的致病机理有望得到阐明。寻找与特定遗传疾病有关 的基因的工作变得容易。 、 在医学领域的应用 (1)对特殊疾病基
13、因的确定 通过认识特殊疾病的基因序列,为疾病的诊断和治疗提供了可能。如家族性早 老年痴呆症、视网膜母细胞瘤、亨廷顿舞蹈症。 可提供病人DNA样品序列数据库。通过正常和患者DNA有效分析比较,达到对 疾病基因定位的目的。 (2)有利于优生和产前诊断 通过基因检测,识别出带有遗传疾病的胚胎细胞。在不久的将来,胎儿期的检测 也许能够预测一般的常见病,比如:肥胖症、抑郁症和心脏病等。 (3)加强对癌症的认识和治疗 癌症是由于细胞生长失控造成的。而失控是因特定基因的异常造成的。遗传的缺 陷会使人体对特定的癌症具有高的易感性。一旦确定了易感基因,就可以进行癌 前或早期癌症的特殊监护和治疗。 、在基础理论研
14、究方面的应用 (1)确定人类基因组中基因的序列、组织和物理位置,有利 于研究基因的功能以及基因转录与转录后的调控。 (2)从整体上了解染色体结构,包括各种重复序列以及非转 录序列在染色体结构、DNA复制、基因转录和表达调控中的影 响和作用。 (3)研究正常基因与突变基因的差别,尽快地确定出疾病基 因,对该基因的蛋白产物及其细胞生物学效应进行深入的研究 。 (4)发现新的基因和蛋白质。迄今仅有少数参与正常和疾病 的人类基因被确定。对人类基因组作图和测序将会确定出大量 新的人类基因及其编码的蛋白质。另外,物理图谱将有助于对 那些已大体定位在染色体上,但尚未分离出的基因进行精确定 位。 、在生物学研
15、究领域的应用 生物进化研究 如果知道了人和其它生物基因组的全序列,就有可能追溯出人类基因 的起源。人胚胎的有序发育需要特定的场所和时间的活化,使多潜能细 胞成为新类型的细胞,这一过程至少部分地受控于位于基因附近的调节 顺序。 对人类基因组进行顺序分析,并将与其它哺乳动物进行比较,将使我们 能确定出大量的调节顺序。此外,我们将了解基因调控的规律,及其在 人从其它哺乳动物分化出来的过程中在分子水平上所发生的变化。 人类基因组计划相关的伦理学问题。 一是人类基因组数据的共享, 二是人类基因组信息应用于医学保健方面所产生的问题。 人类基因组所包含的遗传信息是人类的共同遗产,应该为全人类所有。 国际人类
16、基因组科学主流的组织曾发表过多次声明,垄断数据的做法违背 公众的利益,若独占或延误公布将阻碍科学的发展,也不应申请专利。但 不反对对中、下游成果,如功能明确又有工业用途的基因工程产品等申请 专利。这一立场得到各国政府的响应。1996年由国际各大测序中心联合作 出百慕大协议:基因组序列应在24小时之内公布。 2000年3月14日,美国总统克林顿和英国首相布莱尔联合声明支持基因组数 据公开的政策。 2000年6月28日,江泽民主席就人类基因组研究发表的重要讲话中也指出“ 人类基因组序列是全人类的共同财富,应该用来为全人类造福”。 人类基因组计划为推动医学进步带未了空前的机遇。但同时 也可能带来一系
17、列伦理、法律和社会学问题。 例如:病人的隐私权如何得到保护? 他们的就业和保险是否会受到影响? 是否会在社会上受到“遗传歧视”? 社会和法律能够为他们提供何种帮助和保护? 41 抢基因的世纪之战 目前世界上正在进行一场“抢基因”的“世 纪之战” ,其根本动力是基因可以淘金, 从一个肥胖基因能价值9000万美元中, 人们更悟清了这个道理。 2. 基因淘金与基因经济 42 DNA双螺旋与淘金车 43 基因版图 44 哮喘病相关基因的研究材料 取自仅有301个居民的南大西洋一个小岛(全 部是近亲婚配,13的人患有严重哮喘); 我国浙江象山的一个大家系在内的几个大家 系; 通过对芬兰发现的诸多大家系研
18、究,已成功 地克隆了至少12个基因。 目前,实际上已形成了一个被普遍接受的简 单关系式,即: 遗传病家系基因money(钱) 45 人类基因组 计划与伦理 46 基因有没有好坏之分? 当我们说某个基因引起疾病时,称它为“致病基因” 或“有害基因”。但有时被认为致病的基因也可以在 一定情况下对机体起保护作用。 例如在非洲,许多人患有镰形细胞症,这是基因引 起的。但非洲又有致命的恶性疟疾,带有可引起镰 形细胞症基因的携带者却比不带有该基因的健康人 更能抵御恶性疟疾。 这样,“致病基因”在此时变成了“御病基因”。 47 人们在谈论“自私的基因”、“侵略基因”,“利他主 义基因”、“精神分裂基因”、“
19、嗜赌基因”、“嗜酒基 因”、“同性恋基因”时 美国哲学家Nozick R(1990)想象未来的基因超级市 场可提供未来父母购买他们想要孩子所具有性状( 如性别和眼睛颜色)编码的基因。 48 对于可能携带不利基因的任何人,都应公正对待 ,不得歧视;对于基于基因组特征的歧视,应采取 一切适当措施禁止和结束,必要时立法。 保护个人和家庭的基因隐私 HGP一个独特的问题是,谁能得知DNA? 亲人、工 作单位或雇主、保险公司?应该保护个人及其家庭 的基因隐私。 HGP将给人类带来的好处 1、将带动一场医学革命 用基因图谱看病 基因药物治病 基因检测预防隐患 基因治疗疾病 2、获取了操纵生命的工具 控制生
20、命的孕育优生优育 延长人的寿命 选择最佳生活环境 3、得以进行精确的个体鉴定 基因身份证 生物考古 4、将带来巨大的商机 生物制药 器官培植 HGP 可能给人类带来的隐患 社会平等与基因歧视 科技进步与基因技术滥用 社会公正与基因成果利益的均等分配 技术的不确定性和基因安全 后基因组时代 人类基因组计划基本目标与任务只是一个 以测序为主的结构基因组学研究,随着该 目标的实现,“功能基因组学”、“蛋白 质组学”兴起,HGP研究的重心逐步由结构 向功能转移,即基因组功能信息的提取、 鉴定和开发利用。 52The sequence of the human genome 人類基因體計畫 基因变异致病
21、类型 内源基因的变异: 基因结构突变 基因表达异常 外源基因的入侵: 基因诊断和基因治疗 遗传性疾病 肿瘤、心脑血管病等 (生殖细胞) (体细胞) 病毒感染性疾病:HIV、SARS、HCV、HPV 第 一 节 基 因 诊 断 Genetic Diagnosis 特点: 针对性强:病因学检测 特异性强:分子杂交技术 灵敏度高:PCR、分子杂交放大效应,样品量少 适应性强:内源、外源基因 早期快速诊断: 一、基因诊断的概念和特点 定义: 是用放射性同位素、荧光分子等标记的DNA分子做探针 , 利用DNA分子杂交原理,鉴定被检测标本上遗传信息, 达到检测疾病的目的。 二、基因诊断常用技术方法 (一)
22、核酸分子杂交技术 (二)聚合酶链反应 (PCR) (三)基因测序 (四)基因芯片 不同的DNA探针具有不同的核苷酸序列,用其与 被测样品杂交,根据杂交后分子双链的程度确定 被测样品与探针碱基序列的相似程度 二、基因诊断常用技术方法 限制性内切酶谱分析法 DNA限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RLFP)间接分析 (一)核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术原理: 核酸分子杂交的流程示意图 待测核酸制备 滤膜上核酸固化 杂 交 去除未参与杂交的探针 检 测 杂 交 信 号 制备探针核酸片段 探 针 标 记 加入标记核酸探针 Mst酶
23、切位点(GCTNAGG) 53 正常基因 53 突变基因 1.15kb 1.35kb 1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 0.2kb 正常珠蛋白基因: 5CCTGAGG3 镰刀型贫血 : 5CCTGTGG3 + + 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人突变携带着患者 1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 DNA多态性:中性突变导致个体间核苷酸序列的差异 限制性长度多态性分析: 突变发生在酶切位点上,酶切DNA片段不同长度 RFLP:孟德尔方式遗传,家族中,与某一疾病紧密连锁 ,作为遗传标志,判定家族成员是否携带致病基因 应用:甲型血友病、囊性纤维病变、苯丙酮尿症 2
24、. DNA限制性长度多态性分析 RLFP分析法 单基因病-苯丙酮尿症I I 型型 病因:肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶病因:肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶(Phenylalanina Hydrozylase,PAH)缺乏。缺乏。 主征:智力低下,尿有霉味主征:智力低下,尿有霉味 治疗:新生儿诊断明确后,即用低苯丙氨酸饮治疗:新生儿诊断明确后,即用低苯丙氨酸饮 食控制血中苯丙氨酸浓度,食控制血中苯丙氨酸浓度,改善脑子的发育,改善脑子的发育, 而而“ “危险期危险期” ”一过,病婴后来就基本正常。一过,病婴后来就基本正常。 PAHPAH仅仅仅仅存在于肝存在于肝脏细脏细脏细脏细 胞中,在胞中,在绒绒绒绒毛、羊毛
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