发酵工程第四章发酵工业的无菌技术.ppt
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1、4 发酵工业的无菌技术,4.1 发酵工业的无菌处理,灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。,控制有害微生物主要有以下几种措施:,杀灭病原微生物,杀灭一切微生物,4.2 发酵工业污染的防治策略,什么是染菌? 发酵过程中除了生产菌以外,还有其它菌生长繁殖。,1)由于杂菌污染,使发酵培养基因杂菌的
2、消耗而损失,造成产率的下降; 2)由于杂菌所产生的某些代谢产物,或染菌后发酵液某些理化性质的改变,使产物的提取变得困难,造成得率降低或使产品质量下降; 3)污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败;,4.2.1 杂菌污染的危害,4)污染的杂菌大量繁殖,会改变反应介质的pH,从而使生物化学反应发生异常变化; 5)发生噬菌体污染,微生物细胞被裂解而使生产失败等。,染菌危害的具体分析 (1)染菌对不同菌种发酵的影响,A细菌 谷氨酸(棒状杆菌):发酵周期短,培养基不太丰富,较少染杂菌,但噬菌体威胁大。 肌苷(枯草杆菌):缺陷型生产菌,培养基丰富,易染菌,营养成分迅速被消耗,严重抑制菌生长和合成代谢产物。,
3、B. 霉菌 PenG:绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶,而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期,染有能产生青霉素酶的杂菌,都能使青霉素迅速破坏。 青霉素水解酶上升,PenG迅速破坏,发酵一无所获。 柠檬酸:pH2.0,不易染菌,主要防止前期染菌。,链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得,但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养,干扰生产菌的正常代谢;改变pH,降低产量。 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌,对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。,青霉素:怕染细短产气杆菌 链霉素:怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素:怕染双
4、球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸:怕染青霉菌 肌苷(酸):怕染芽孢杆菌 谷氨酸:怕染噬菌体,易造成连续污染,C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗生产:危害很大,现在疫苗多采用深层培养,这是一类不加提纯而直接使用的产品,在其深层培养过程中,一旦污染杂菌,不论死菌、活菌或内外毒素,都应全部废弃。因此,发酵罐容积越大,污染杂菌后的损失也越大。,污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫,即使添加消泡剂也无法控制逃液,影响发酵过程的通气搅拌。 有的杂菌会使发酵液发臭、发酸,致使pH下降,使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌,由于芽孢耐热,不易杀死,往往一次染菌后会反复染菌。,由于
5、接种量较小,生产菌生长一开始不占优势,而且培养基营养丰富,容易污染杂菌。种子染菌对发酵危害极大,应严格控制种子染菌,如在此阶段染菌,应将培养液全部废弃。,(2)不同发酵时期染菌对发酵的影响,1)种子培养期染菌,2)发酵前期染菌,发酵前期最易染菌。 原因 发酵前期菌量不很多,与杂菌没有竞争优势;且还未合成产物(抗生素)或产生很少,抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。 措施 如果前期染菌,且培养基养料消耗不多,可以重新灭菌,补加一些营养,重新接种再用。,发酵中期染菌,处理困难,危害很大。,3)发酵中期染菌,发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸,培养液pH下降;糖、氮消
6、耗快,发酵液发粘,菌丝自溶,产物分泌减少或停止,有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭,产生大量泡沫。 措施 降温培养,减少补料,密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐,或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐,抑制杂菌。,4)发酵后期染菌,发酵后期发酵液内已积累大量的产物,特别是抗生素,对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多,对生产影响不大。如果染菌严重,又破坏性较大,可以提前放罐。,(3)杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响,1)发酵染菌对过滤的影响,染菌的发酵液一般发粘,菌体大多数自溶,所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼,导致过滤
7、困难。,污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异,如污染霉菌时,影响较小,而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难,过滤时间拉长,影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用,破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率,直接影响提取总收率。,丝状菌发酵被产酸菌污染:pH不断下降,菌丝大量自溶,发酵液粘度增加,过滤困难 预处理方法:将发酵液加热后再加助滤剂;先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀 杂菌分泌较多蛋白质杂质时,对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利,使水相和溶媒之间极易发生乳化,染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺,则极易发生乳化,很难使
8、水相和溶剂相分离,影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺,如链霉素、庆大霉素,染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面,或被离子交换树脂吸附,大大降低离子交换树脂的交换容量,而且有的杂菌很难用水冲洗干净,洗脱时与产物一起进入洗脱液,影响进一步提纯。,4.2.2 杂菌污染的防治 1. 染菌的检查与判断,显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间 平板划线培养或斜面培养检查法:菌落 噬菌体检查可采用双层平板法:噬菌斑 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断 DO2水平异常变化 pH异常变化 尾气CO2异常变化,双层平板法,底层平板(2琼脂培养基10mL),上层平板,上层培养基(1琼脂培养基5mL
9、),宿主菌悬液(对数期菌液0.2mL),噬菌体试样(合适稀释液0.1mL),混匀,37,10余h,计数噬菌斑,溶解氧水平的异常变化 感染噬菌体,生产菌的作用受到抑制,溶氧浓度很快上升。 污染好氧性杂菌,溶解氧在短时间内下降,并接近零值,长时间不能回升; 污染非好氧性杂菌,生产菌受到抑制,耗氧量减少,溶解氧升高。,1,2,尾气中CO2含量异常 污染杂菌,糖耗加快,CO2含量增加;感染噬菌体,糖耗减慢,CO2含量减少。,pH异常 对于污染产酸菌或利用碳源效率高生长较快的杂菌,会使pH迅速下降。,2. 污染原因分析,主要原因: 种子带菌 无菌空气带菌 设备渗漏 灭菌不彻底 操作失误 技术管理不善,日
10、本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析 项目 百分率% 种子带菌或怀疑种子带菌 9.64 接种时罐压跌零 0.19 培养基灭菌不透 0.79 总空气系统有菌 19.96 泡沫冒顶 0.48 夹套穿孔 12.36 盘管穿孔 5.89 接种管穿孔 0.39 阀门渗漏 1.45 搅拌轴密封渗漏 2.09 罐盖漏 1.54 其它设备渗漏 10.13 操作原因 10.15 原因不明 24.94,1)从污染杂菌的种类分析 污染耐热芽孢杆菌:培养基或设备灭菌不彻底; 污染不耐热杂菌:种子带菌、空气除菌不彻底、设备渗漏或操作问题; 污染浅绿色菌落杂菌:冷却盘管渗漏引起; 污染霉菌:无菌室灭菌不彻底
11、,或操作问题; 污染酵母菌:糖液灭菌不彻底。,2)从污染时间分析 发酵前期染菌:种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、操作不当或空气带菌; 发酵后期染菌:中间补料污染、设备渗漏或操作问题。 3)从染菌程度分析 多个罐染菌:种子带菌、空气系统问题; 个别罐染菌:设备问题、操作不当。,3. 预防,(1)种子带菌及其防治发酵前期 种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理,严格无菌操作,种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。,培养基及器具彻底灭菌灭菌锅使用 避免菌种在移接过程中受污染无菌室 避免菌种在培养过程或保藏过程中受杂菌污染,无菌室要求,在无菌室中装
12、有紫外灯,打开紫外灯,照半小时,关灯后15分钟再接种。 用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、拖地. 接种时必须在超净台上操作,超净台装有一台鼓风机,进风口有一粗过滤器,出风口有高效过滤器,保证无菌风从超净台吹出,外界有菌空气不可能进入接种区域,保证无菌条件。 接种人员必须穿好无菌服,戴好口罩,手用酒精棉球擦干净。,(2)过滤空气带菌及其防治,从日本工业技术院分析空气带菌而造成的染菌为19.96。国内外空气除菌技术虽已有较大改善,但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂,环节多,不慎便会导致空气除菌失败。,正确选择采气口 保持过滤介质的干燥 设计和安装合理的空气过
13、滤器,(3)设备渗漏或“死角”,设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现,这类染菌占33.85。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查,对制服染菌是极其主要的,也是重要的。,密闭式发酵罐,2、机械搅拌发酵罐的结构,好气性机械搅拌发酵罐是密封式受压设备,主要部件包括: 罐身 轴封 消泡器 搅拌器 联轴器 中间轴承 挡板 空气分布管 换热装置 人孔以及管路等,“死角”,发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 口:人孔(或手孔
14、)、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法:加强清洗并定期铲除污垢;安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”,灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法,发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”,法兰连接不当造成的“死角”,(4)灭菌不彻底,灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系 升温快慢、保温时间,泡沫 蒸汽总压是否达到要求标准 环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。如上海第四制药厂在卡那霉素生产中,于炎热的夏季将连续灭菌预热至80的培养基采样培养,可发现无法计数的大量的芽孢杆菌;而在冬季取样的培养中,则仅发现23个芽孢杆菌。,培养基与设备灭菌不彻底的防治
15、原料性状:大颗粒的原料过筛除去 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌:添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 :最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角 操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治,4.3 发酵工业的无菌技术灭菌方法,干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法,1)化学试剂灭菌法: 常用试剂有甲醛、氯气(或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐(如新洁尔灭)、臭氧等。这些物质易与微生物细胞中的一些成分产生化学反应,如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性而杀灭微生物。 由于化学试剂也会与培养基中的一些成分作用,而且加入培养基
16、后不易去除,它不能用于培养基的灭菌,但染菌后的培养基可用化学药剂处理。,2)辐射灭菌: 利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。如紫外线(穿透力低,仅适用于表面消毒和空气消毒)与菌体核酸的光化学反应而使菌体死亡;0.01-0.14nm的X射线、Co60产生的射线,它们含极高的能量,可使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应,形成OH-、H2O2和有机过氧化物,从而在微生物体内引起氧化连锁反应,导致微生物菌体迅速死亡。近年兴起了微波灭菌。,3)过滤除菌法 适用于澄清液体和气体的除菌。是将液体或气体用微孔薄膜过滤,使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留,从而达到除菌目的。用于遇热容易变性而失效的试剂
17、或培养液。,4)干热灭菌法 160下保温1-2h。干热对微生物有氧化、使细胞蛋白质变性和电解质浓缩等效应而使菌体死亡。 5)火焰灭菌法 灭菌彻底,但仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。,6)湿热灭菌法: 湿热灭菌要比干热灭菌更有效,这一方面是由于湿热易于传递热量,蒸汽具有很强的穿透能力,而且在冷凝时会放出大量的冷凝热,另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构,从而加速其变性。很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。 一般的湿热灭菌条件:121,30min。,高压蒸汽灭菌是发酵工业最常用的方法,能有效地杀灭杂菌,但高温也破坏培养基的营养成分。,消除高温有害影响的措施,(1)对易破
18、坏的含糖培养基进行灭菌时,应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并; (2)对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌,然后再混合,就不易形成磷酸盐沉淀;,(3)对含有在高温下易破坏成分的培养基(如含糖组合培养基)可进行低压灭菌(在112即0.57kgcm2或8磅英寸2下灭菌15分钟)或间歇灭菌; (4)在大规模发酵工业中,可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌。,7)间歇灭菌法,又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。 方法是:将待灭菌的培养基在80100下蒸煮1560min,以杀死其中所有微生物的营养细胞,然后置室温或37下保温过夜,诱导残留的芽孢发芽,第二天再以同法蒸煮
19、和保温过夜,如此连续重复3天,即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。,4.4 发酵培养基及设备管道灭菌,热死时间-衡量湿热灭菌的指标 是指在规定的温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。 加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。,湿热灭菌的原理,1 微生物的热阻 杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下,杀死全部微生物所需的时间称为致死时间;在致死温度以上,温度愈高,致死时间愈短。 微生物的热阻:是指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热方式)下的致死时间。 相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。,各种微生物对湿热的相对热阻,2. 微生物热死定律对
20、数残留定律,实验证明,在一定温度下,微生物营养细胞的均相热死动力学符合化学反应的一级反应动力学,即:对微生物进行湿热灭菌时,培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比,这就是对数残留定律。,式中, N:任一时刻的活细菌浓度(个/L); t:时间(min); K:比热死速率常数(min-1).,若开始灭菌(t = 0)时,培养基中活的微生物数为N0,t = 2.303 logN0/N /k,- dN/dt = N,lnN/N0 = - t,积分,2.303logN0/N = t,or,可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度(残留菌数N)和k值,例: 有一发酵罐内装40m3培养基
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