培训3-植物基因工程技术及应用.ppt
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1、二、植物基因工程技术及应用,1.植物基因工程技术 先将特定的目的基因分离,然后利用载体、媒体或其它的物理、化学方法将分离的目的基因导入植物细胞受体,并整合到植物受体细胞的染色体(基因的载体)上,从而获得目的基因在植物受体中的表达,最终达到改变植物性状(如抗并抗虫、抗逆等)以及快速培育植物新品种的目的。 2. 转基因植物 是拥有来自其他物种基因的植物。指通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。 2008年中国转基因作物种植面积为世界第六位,作物品种包括棉花、番茄、杨树、牵牛花、抗病毒木瓜和甜椒,转基因植物,种植的转基因植物种类主要有大豆(占54)、玉米(占28)、棉花(占
2、9)、油菜(占9),马铃薯、西葫芦和木瓜的比例都小于1。按转基因植物的性状划分,抗除草剂占71,抗虫占22,抗虫兼抗除草剂占7,抗病毒和其他性状转基因植物的比例小于1。 至1999年,农业部批准可进行商业化生产的国内研制的转基因植物有5种,它们分别是:抗虫棉花、改变花色的矮牵牛、延熟番茄、抗病毒的甜椒和番茄。,(一)转基因植物发展进程与规模,1983年,首批转基因作物(烟草、马铃薯)问世。 1986年,首批转基因作物(抗虫、抗除草剂)进入田间实验,美国和法国同时对抗除草剂转基因烟草进行了田间试验 1992年,中国首先在大田种植转基因抗病毒烟草,揭开了全球转基因作物商业化的序幕。 1994年,美
3、国转基因作物产品(耐储存番茄Flavor Savor )进入市场。 1994年,商品化种植抗黄瓜花叶病毒(CMV)和抗烟草花叶病毒(TMV)双价的转基因烟草 1996年后,转基因作物的产业化得到迅速发展。 同时带有八种基因代码的转基因玉米将于2010年在美国问世。,1998年,全世界共有 7000万英亩大田种植转基因作物。 1999年又增至 9860万英亩,年增长率超过 40%。 2000年年增长率突降至 10.8%,其中美国的降幅最大。,2009年2月24日统计 种植面积排名前三位的国家分别为,美国(6250万公顷)、阿根廷(2100万公顷)和巴西(1580万公顷)。中国全国生物技术作物种植
4、面积达380万公顷,在全球生物技术作物种植面积超过100万公顷的八个国家中排名第六 种植面积排名前十的国家,依次是美国、阿根廷、巴西、加拿大、印度、中国、巴拉圭、南非、乌拉圭、菲律宾。,商业化种植转基因作物的国家数,年份,国家数,(亿美元),国际农业生物技术应用跟踪调查服务处(ISAAA)的估计,全球转基因产品的市场:,转基因产品市场现状与展望,美国是转基因食品的发源地,也是当今世界转基因食品生产和出口最多的国家。1983年,全球第一个转基因农作物马铃薯就诞生在美国。据估计,目前美国的零售食品中有60%以上含有转基因成分,90%以上的大豆、50%以上的玉米、小麦是转基因的。,采用现代生物技术手
5、段,培育出一批优质、专用、高产、多抗农作物新品种。转基因技术与产业化快速发展,我国已成为世界第五大转基因植物种植国家,2006年,我国棉花种植面积8095万亩,其中生物技术棉花种植面积已超过总面积的75%,河北、山东、河南、安徽等棉花主产省的国产生物技术棉花种植率已达到100%,棉花单产达到80千克/亩的历史高水平,增幅为6.3%-7.0%,棉花总产量达650万吨,创历史新高,且棉花品质普遍看好。通过数字农业技术的应用,大幅度提高了示范区农业信息化和现代化管理水平,加速了利用高新技术改造传统农业的步伐。,1. 提取DNA,(二)转基因技术,有SDS法和CTAB法,常采用CTAB法提取方法基因组
6、DNA。,并用分光光度计测定浓度和质量。然后用去离子水将其稀释至50nguL-1备用,叶片加液氮,快速研磨成粉末,DNA提取缓冲液2CTAB,充分混匀,60水浴45-60 min,其间轻柔摇匀2-3次,冷却至室温,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)轻柔且充分混匀,静置10 min,12000 rpm离心10 min,取上清,加入0.7倍体积的冷异丙醇,轻柔摇动离心管充分混匀,室温放置10-20min,10000 rpm离心10 min,小心弃去上清,加入70%的乙醇洗涤2次沉淀,室温下微干,溶于适量TE缓冲液,DNA检测用0.8% 的琼脂糖胶,15000 bp 1000 bp 250 bp,(
7、1)获得目的基因方法 从生物基因组群体中分离目的基因 采用限制性内切酶切割,2. 获得目的基因,DNA 1g,缓冲液 2L,重蒸水,酶液,+,用手指轻弹管壁使溶液混匀,使溶液集中在管底,混匀反应体系后,37水浴保温2-3h,电泳检测,EP管编号, 加样,操作步骤,化学合成目的基因DNA片段 采用DNA合成仪 PCR(聚合酶链式反应) 合成DNA 常用的方法,PCR过程示意图,mRNA差异显示法获得目的基因 基因在细胞中的特异表达与否,决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期的调节、细胞衰老和死亡等。用于分离特异表达的基因。 用机械的方法 如超声波把基因组打成片段。,(2)PCR获得目的基因,
8、 设计引物 在NCBI(美国国立生物技术信息中心) http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ 引物设计软件Primer primer5.0 设计引物,然后合成引物。,PCR反应混合液,扩增条件:9460s,3760s,72120s,共2530个循环。,PCR,特异片段的回收、连接与转化,将扩增产物用1%琼脂糖凝胶(EB染色)在100V电压的电泳液中电泳40min,在紫外灯下用刀片切取带有特异带的胶块,并把该胶块转移到1.5ml离心管中,回收片段按照胶回收试剂盒进行,目的片段与克隆载体的连接(pGEM T easy vector或 pMD18-T )在4条件下连接12h-16h,采
9、用热激法,将连接产物的转化转化至大肠杆菌的感受态细胞E.coli JM109,将全部菌液涂于含 Amp(X-gal为40l,IPTG为4l)的 LB平板上,半小时后倒置,37培养8-12h左右,可出现菌落,克隆的筛选与鉴定,蓝白斑筛选 重组子的PCR鉴定 质粒的提取及质粒的酶切鉴定,测序 送生物技术公司,用DNA测序仪测序。,序列比对 在NCBI或者DNAman上进行比对,确认基因是否正确。,3. 构建植物表达载体,(1)载体 在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。按用途分为:克隆载体,表达
10、型载体, 分泌型载体,穿梭载体等。一是用它作为运载工具 ;利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。,在宿主细胞中能保存下来并能大量复制; 有多个限制酶切点,而且每种酶的切点最好只有一个,可适于多种限制酶切割的DNA插入; 含有复制起始位点ori ,能够独立复制; 有一定的标记基因,便于进行筛选。,载体必须具有四个条件,能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝粒, 端粒 方便插入外源片段: 酶切位点 选择标记: 药物抗性 报告基因: 插入筛选标记 易分离提取 高产率(多拷贝) 强启动子 多宿主,Transform,+report gene substrat
11、es,(1)转化方式 根据所用载体类型以及转化对象不同一般有以下主要转化方式: (1) 基因枪转化 ( 2) 电转化 (3 )融合法 (4 )花粉管转化 ( 5 )农杆菌介导,4. 高等植物基因的转化与植株再生,(1) 基因枪转化法,利用基因枪的装置,将钨粉或金粉与DNA吸附制成“子弹”通过高压放电将“子弹”加速到482m/s,在这种速度下,金属粒子能穿透植物细胞壁,击发一次可将成千上万个带有外源DNA的金属粒子同时射入完整的细胞或器官。 优点:单子叶和双子叶都可使用 缺点:成本高,操作麻烦,的DNA片段整合效率极低。通常只应用于单子叶。,(2) 电击法,用电转化仪将高浓度的质粒DNA加入到植
12、物细胞的原生质体悬浮液中,混合物在 200 - 600 V / cm 的电场中处理若干秒钟,然后将原生质体在组织培养基中生长 1 - 2 周,再生出整株植物。,(3) 融合法,将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合,在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体,后者与植物细胞原生质体融合,筛选融合子,再生植物细胞壁。,原生质体很难再生出整株植物。,(4) 花粉管导入法,使用显微注射器,将外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中,实现基因的转移。是由我国科学家周光宇首先提出设计的,目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究,,花粉管导入
13、法的特点是直接、简便。它的受体材料为植株整体,省略了细胞组织培养的诱导和传代过程,排除了植株再生的障碍,特别适合于难以建立有效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞,导入的DNA分子整合效率较高。,(5) 农杆菌介导,几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤,这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌(A.tumefaciens)感染所致,其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti介导的。,二元整合转化程序,将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内;,重组质粒直接转化农杆菌株,该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质
14、粒;,(2)农杆菌介导外源基因转移技术的一般操作,将表面消毒的叶片切成小块 小块在过夜培养并稀释到一定浓度的含外源基因的根癌农杆菌液中共培养几分钟,使让根癌农杆菌感染叶片切块的伤口。 从菌液中捞出小叶块,培养基中培养2天。 在含头孢霉素选择培养基中筛选转化细胞。继续培养,转化的细胞分化出芽。 将芽转入含有抗生素的生根培养基上,诱导生根。 将完整的转基因植株移栽到土壤中。,a,b,c,d,分子鉴定 : PCR Southern blot Northern blot Western blot 蛋白质电泳,5. 转基因植株的鉴定及分析,Southern blot,Northern blot,West
15、ern blot和蛋白质电泳,(三)转基因生物商业化的一般流程,1. 实验室试验环节:通过了实验室的试验,技术成熟之后才开始进行中间试验环节。 2. 中间试验环节:这个环节在田间进行,一般需要两年左右的时间。田间的管理评价包括具体位置、与人群的距离、面积、隔离等多项具体规定。 3. 环境释放评价:需要两年。在这个环节试验可以再扩大一些面积,但也有很多要求,也必须在相对封闭的环境下进行。 4. 生产试验:生产试验的规模可以进一步扩大。本阶段的评价主要是评估转基因生物对环境是否有影响和压力。 5. 如果要做食品,需要再对独立性、致敏性、抗营养因子等进行评价,还需要提交综合性评价。” 按照中国现行的
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