复件选修3问题释疑.ppt
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1、现代生物科技专题 问题释疑,基因工程,1限制酶和质粒都是只存在与细菌中吗?,不是。 不但细菌中存在限制酶和质粒,在酵母菌中也有限制酶和质粒。,限制酶和质粒实质分别是什么?,蛋白质 DNA,不同的限制酶可以切出相同的黏性末端吗?,可以,比如G AATTC-和 AATT-,基因工程,微生物中限制酶之所以不切断自身DNA,是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制,对于外源入侵的DNA可以降解掉。 微生物在长期演化过程中,含有某种限制酶的细胞,其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列(类似于人体的凝集原于抗凝集素的关系),或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基(A、C)上,
2、使限制酶不能将其切开。这样,尽管微生物中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断,并且可以防止外源DNA的入侵。,2为什么微生物中的限制酶不剪切自身的DNA?,基因工程,3.限制酶的组合使用(双酶切)问题,(2008海南生物卷)图为某种质粒表达载体简图,小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI(GAATTC)、BamHI (GGATCC)的酶切位点,ampR为青霉素抗性基因,tctR为四环素抗性基因,P为启动因子,T为终止子,ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。 (1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切,酶切产物用DN
3、A连接酶进行连接后,其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒,需要对这些连接产物进行分离纯化。 (2)在上述实验中,为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接,酶切时应选用的酶时 。,基因工程,同一种限制酶相同限制酶(P6),仅用限制酶EcoRI(GAATTC)切割:,限制酶EcoRI(GAATTC)和BamHI (GGATCC)联合切割:,基因工程,4.双标记基因问题,下图a示基因工程中经常选用的载体pBR322质粒,Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中,将使该基因失活,而
4、不再具有相应的抗性。为了检查载体是否导入原本没有Ampr 和Tetr的大肠杆菌,将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上,得到如图b的结果(黑点表示菌落)。再将灭菌绒布按到图b的培养基上,使绒布面沾上菌落,然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养,得到如图c的结果(空圈表示与b对照无菌落的位置)。,a,b,Ampr,Tetr,c,基因工程,7.目的基因表达的检测方法怎样?,检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 (2)常用的技术: 利用DNA-RNA分子杂交看否生成了相应mRNA; 用抗原抗体发生特异性结合看是否合成了相应的蛋白质; 从个体水平看是否表现出特定的性状,如用
5、棉花叶喂虫,看虫食用后是否死亡判断抗虫基因在棉花植株上的表达。,目的基因,相应的蛋白质,mRNA,翻译,转录,基因工程,插入哪一条染色体、插入某一染色体的位置都是随机的,还有可能破坏正常基因的结构和功能,使受体细胞不能完成某项生命活动甚至死亡。,5目的基因插入动植物细胞基因组的随机性问题,基因工程,分泌蛋白需要内质网、高尔基体等的加工分泌才能完成的。,6基因工程中生产胰岛素,为什么选大肠杆菌为受体细胞生产的是胰岛素原?,从这个角度考虑可以用什么生产?,基因工程,教材基因治疗的例子中,以T淋巴细胞为目标细胞导入正常功能的基因,经筛选和细胞培养后输入患者的骨髓组织中,以纠正或补偿基因的缺陷,达到治
6、疗疾病的目的。这里有同学疑问:“T淋巴细胞能在细胞培养中会增殖吗?” 答案是肯定的,T淋巴细胞能在细胞培养中会通过有丝分裂增殖。如在细胞免疫时,当T淋巴细胞接受抗原刺激后,能增殖分化为效应T淋巴细胞(大多数)和记忆细胞(少量)。,7.T细胞能增殖吗?,克隆技术,植物组织培养是将离体的植物器官(根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织(形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚(成熟和未成熟的胚)、胚乳、原生质体等,在无菌条件下培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件,诱发产生愈伤组织、胚状体或不定芽等,再长成完整的植株,统称为植物组织培养。,8植物组织培养的过程,培养基成
7、分(1)营养物质: (2)生长调节剂 (3)凝固剂,环境因素: 温度?无菌?光?,克隆技术,很多作物都带有病毒,尤其是无性繁殖植物,如马铃薯、甘薯、草莓、大蒜等。长期的病毒感染并在植物体内的积累,使植物的产量和品质不断下降,比如草莓越来越小。 植物茎尖或根尖的很少受病毒感染甚至无病毒。利用组织培养方法,取一定大小的茎尖进行培养,再生的植株有可能不带病毒,从而获得脱病毒苗,再用脱毒苗进行繁殖,种植的作物就不会或极少发生病毒。 此外,组培可以用来快速繁殖,可以在育种后进行运用,9植物组织培养在植物脱毒上的应用,取材少、繁殖率高;培养周期短;不受季节限制; 便于自动化管理;培养无病毒植株(根尖、茎尖
8、) 保持亲本的优良性状(无性繁殖),克隆技术,培养细胞均处在不断分生状态,容易受培养条件和外界压力(如射线、化学物质等)的影响而产生诱变,筛选出已诱发植物的突变体,然后分化成植株。 目前用诱发细胞突变培育方法已筛选到抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的突变体,有些已用于生产。,10诱发细胞突变育种问题,克隆技术,一种筛选甘薯耐盐突变体的方法,用高盐溶液进行组织培养或用高盐溶液灌溉植物,(1)离体的动物细胞能否正常的生活、表现出正常的生命活动?,只要条件适合就能表现出正常的生命活动,如细胞的分裂、生长等,(2)是不是所有的动物细胞都能在离体的情况下表现出生命活动?,不是,越是幼嫩的细胞越容易
9、培养并表现出正常的生命活动,因此在细胞培养时一般选择幼嫩的细胞,(3)动物细胞培养时有没有细胞分化?,有,克隆技术,分散成单个细胞后容易培养,细胞所需的营养容易供应,其代谢废物容易排出;而用大块组织培养时,内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难,因此,这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时,分散成单个细胞培养,可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。 用酶消化的是细胞间基质,细胞间基质主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用胰蛋白酶可使其消化,从而使细胞相互分离。不能用胃蛋白酶,11为什么动物细胞要分散成单个细胞培养?用酶消化的是什么物质?,克隆技术,原代培养
10、:将组织从机体取出后,先用胰蛋白酶处理使组织分散为单个细胞,然后在用细胞悬浮液进行培养的过程。 当原代培养到一定时期,细胞会因为密度过大和代谢消耗引起营养枯竭,有害代谢产物积累,导致细胞不能正常生长;贴壁生长的话还会出现接触抑制现象,所以需要进行传代培养。 传代培养:将原代细胞从培养瓶中取出,配制成细胞悬浮液,分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养,称为传代培养。 所以,分瓶前的培养是原代培养,分瓶后的培养为传代培养。,12原代培养和传代培养的比较,克隆技术,细胞系:原代培养物开始第一次传代培养后的细胞称之为细胞系。 其中,能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系,不能连续培养的细胞称为有
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