目的基因的制备-基因文库法.ppt
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1、1/46,目的基因,需要克隆的DNA片段。,编码某种蛋白质,研究某基因结构和功能的关系,研究某基因与疾病的关系,2/46,目的基因的获取/制备,人工合成,cDNA文库 基因组文库,聚合酶链式反应,1. 基因文库,2. cDNA文库,3.人工合成,4. PCR,3/46,基因组文库(genomic library),4/46,分离基因组DNA,DNA片段与载体连接,导入细胞,筛选,限制性内切酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,5/46,以 l 噬菌体制作基因 组文库 , 在一个基因组文库面 , 所有可能的 基因皆被大量复制 。 利用探针筛选特定基因 。,6/46,组织或细胞染色体DN
2、A,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合.,从基因组文库获取目的基因,每个细胞含有一个基因组DNA片段与载体的重组DNA分子,许多细胞组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体.,genomic library,7/46,基因库是通过重组技术转化筛选而建立,利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快、繁殖能力强的特点作为一种核酸扩增的载体,把人类等高等生物的基因或其片段重组其中,成为便于保存、取用方便的基因库。建立基因库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和纯化。,8/46,基因组文
3、库的质量评价和完备性,基因组文库必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何序列。基因组文库完备性是指从基因组文库中筛选出含有某一目的基因的重组克隆的概率。 如果满足两个条件:生物体染色体DNA片段被全部克隆,用于构建基因文库的DNA片段含有完整的基因,则此基因文库的完备性就是1。 用基因组文库的克隆数表示基因组文库的大小即库容量。,9/46,1.理论值,基因组文库的克隆数目(N),基因组DNA总长,DNA插入片段的平均长度,某种生物基因组DNA总长度为3106 kb,酶切后的DNA片段平均长度为15 kb,则基因组文库的克隆数应为 3106 kb/15 kb= 2105个克隆。 在实际工
4、作中,由于在基因组文库的构建过程中存在多步操作,一个具备完好代表性的基因组文库的库容量大大超过这个理论值。,10/46,2.经验值,ln(1f/g),N =,ln(1P),P为从文库中选出任一基因或DNA序列的概率即完备性, 一般 设为99(0.99); f为载体容量(kb); g为基因组大小(kb); N为基因组文库的克隆总数,表示文库中以P概率出现某段DNA,理论上应具有的最少克隆数;,11/46,人单倍体DNA总长为3109bp 若载体装载量为15kb 则构建完备性为 0.9 的基因组文库 大约需要 个重组克隆.,完备性 0.99 0.999 0.9999,46万,库容量 92万 138
5、万 184万,?,12/46,表 几种典型生物基因组文库大小与载体容量的关系,13/46,选择载体的主要参数是基因组大小,构建大肠杆菌(4.6106bp)等基因组较小生物的基因组文库时,按每个DNA片段平均长5kb计算,一个包括5000个DNA片段克隆的基因文库就能够代表一个完整的大肠杆菌基因组序列,采用质粒作为载体便可得到满意的结果。 构建较大基因组的文库时,噬菌体、粘粒及YAC常选作克隆载体。 基因组文库分为:质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库(细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等)。,14/46,可获得的基因,HGP,对比分析内含子、外显子及调控区域,基因原始结构功能的研
6、究,应用范围,该种生物所有基因,15/46,cDNA文库(cDNA library),16/46,逆转录,以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。,17/46,逆转录病毒细胞内的逆转录现象:,逆转录现象说明:至少在某些生物,RNA同样具有遗传物质的传代与表达功能。,18/46,逆转录酶的应用:,应用于基因工程,基因,mRNA,蛋白质多肽链,19/46,尿素-氯化锂法 硫氰酸胍法 polyT亲和层析法 密度梯度离心分级法 探针筛选法,mRNA的提取与纯化,20/46,polyT亲和层析法,polyT,polyT,polyT,21/46,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,cDNA文库的组建,
7、1.mRNA提取 2.cDNA合成 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 3.双链cDNA的分子克隆 4.双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖.,22/46,mRNA分离纯化,反转录合成cDNA,构建cDNA文库,筛选目的基因,23/46,反转录合成单链cDNA,24/46,置换合成法合成cDNA第二链,25/46,引物-衔接头法合成cDNA第二链,26/46,包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合 称该组织细胞的cDNA文库.,基因组基因在特定的组织细胞中只有一部分表达,且在不同条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同,cDNA文库具有组织细胞特异性
8、。,27/46,cDNA文库的质量评价,高丰度mRNA的cDNA 克隆所占的比例高,分离容易, 低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例低,分离困难。,mRNA根据其在细胞中的拷贝数即丰度,低丰度:拷贝数在1至15间,中等丰度:拷贝数在100至1000间,高丰度:拷贝数在1,000至10,000间,28/46,1.文库的代表性,cDNA文库代表性指文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息(即mRNA种类)的完整性,可用库容量来衡量,指构建的原始cDNA文库中所包含的重组子克隆数,库容量取决于细胞中表达出的mRNA种类和每种mRNA序列的拷贝数。cDNA文库库容量理论估算: 细胞总mRN
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