第2章生物样品前处理.ppt
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1、现代生化分离技术 Separation Methods in Biochemistry,2,第二章 生物样品前处理,第二章 生物样品前处理,3,第二章 生物样品前处理,第一节 样品分离的预提取 第二节 细胞的破碎与分离,第一章 绪论,4,第二章 生物样品前处理,第一节 样品分离的预提取(前处理),前处理的目的:对目标组分进行初步富集,对干扰成分进行去除;,2.1.1 概述,预处理材料的种类和特点,动物细胞反应液 植物细胞反应液 微生物细胞反应液 植物组织提取液 动物组织提取液,“发酵液” “产物”,胞内or胞外?,组织,5,第二章 生物样品前处理,2.1.2 植物组织提取物的制备,植物组织材料
2、来源部位不同,前处理方法不同。 叶片、根、茎清洗去泥沙、灰尘等杂质(-4C -30C低温保存备用); 种子(大豆、莲子)、中药提取的原材料等泡涨,粉碎。,6,第二章 生物样品前处理,一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中提取,大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞组织中,酶和酚类物质处于彼此隔离的状态,细胞组织被破坏后,彼此接触,很容易发生酶促反应,反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应,破坏目的酶的活性。所以要在预处理阶段去除酚类化合物。,2.1.2.1 植物组织中酶的提取,7,第二章 生物样品前处理,例子:植物组织中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取,1. 步骤:,100g新鲜叶
3、片切成小片(打孔器、切片)置入提取液中(稳定酶活性)PVPP预浸泡(不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮,可溶性PVP聚乙烯吡咯烷酮,)间歇高速搅拌(充分接触混匀)纱布过滤滤液加入PVPP重复轻搅(重复一次)离心去除PVPP酶粗提液。,8,第二章 生物样品前处理,2. 条件讨论,低温(45度),器皿、溶液预冷、操作要快; 57倍于固形材料的提取液,搅拌不产生气泡(气泡不利于酶活稳定); PH6.57.0,中性,未知蛋白酶要远离等电点; PVPP优良,不溶性; PPO抑制剂,DTT、2-ME; 蛋白酶抑制剂PMSF(苯甲磺酰氟)酒精溶解,剧毒。,9,第二章 生物样品前处理,2.1.2.2 多糖提取,重要活性多
4、糖 步骤:原料粉碎醇醚回流脱脂水提取粗提液 去蛋白策略:Sevag法,蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性 TCA法,低浓度的TCA可沉淀蛋白质,离心后即可除去蛋白质。,10,第二章 生物样品前处理,2.1.2.3 细菌重组蛋白的提取,重组蛋白:工程菌可表达大量的重组目的蛋白,40%总蛋白含量,但易形成包涵体(蛋白质以不溶形式包涵在细胞质中)。,11,第二章 生物样品前处理,例:E. coli.中提取重组蛋白,1. 步骤:,酶解菌体细胞:离心收集菌体溶菌酶去核酸(DNase)电泳检测; 清洗包涵体:去除杂蛋白,保证包涵体蛋白不被溶解; 溶解包涵体:释放目的蛋白; 目的蛋白再折叠:恢复活性,12,第二章
5、 生物样品前处理,第二节 细胞的破碎与分离,微生物代谢产物: 胞外产物(氨基酸、细菌碱性蛋白酶、糖化酶等) 胞内产物(大多数蛋白质、类脂) 微生物代谢产物大多数分泌到胞外,但有些目标产物存在细胞内部。目前重组DNA技术,表达的产品(如胰岛素、干扰素、白细胞介素等),都是胞内产物。首先必须将细胞破碎,使产物得以释放,才能进一步提取。,2.2.1 概述,13,第二章 生物样品前处理,2.2.2 常用破碎方法,机械法:珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、X-press法等;对物料的挤压和剪切作用 非机械法:酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等;,14,第二章 生物样品前处理,2.2.2.1 珠磨法,原
6、理:,进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂(玻功小珠、石英砂、氧化铝d1mm)一起快速搅拌,细胞与研磨剂之间互相碰撞、剪切,使细胞破碎,释放内含物。 玻璃珠(石英砂、氧化铝等研磨剂)+ 细胞悬浮液研磨释放胞内物,15,第二章 生物样品前处理,破碎过程产生热能,要注意热交换,温度控制夹套冷却,实验室预冷器皿; 适用于绝大多数微生物细胞的破碎 高破碎率,但难以实现固液分离,浆状,特点:,16,第二章 生物样品前处理,高压匀浆器; 细胞悬浮液受高压作用快速从针形阀射出经历剪切、碰撞、高压至常压变化后导致细胞壁和细胞膜的破坏释放胞内物,2.2.2.2 高速匀浆法,原理,17,第二章 生物样品前处理,特
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