第4章吸附层析.ppt
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1、第三章 吸附层析,第一节 概述,一、基本概念和色谱过程,1、概念 色谱法(Chromatography),也称色层法或层析法。此种方法基于混合液中各组分的分子极性、分子大小与形状、吸附力、亲和力等物理化学性质的差异,导致各组分在流动相和固定相之间的分配系数不同,组分在两相间进行连续多次分配,从而彼此分离。 色谱不只是分离技术,也是一种分析方法。,2、色谱过程,3、色谱方法的共同特点: 色谱分离体系都有流动相和固定相两个相。 色谱过程中,流动相对固定相作连续的相对 运动。 被分离样品在两相中具有不同的作用力,各组分混合物在流动相的带动下通过固定相,实现分离。 4、样品在分离时的两个基本点: 混合
2、物中不同组分在柱内的差速迁移 同种组分在色谱体系迁移过程中分子分布离散,二、色谱法分类,1、按两相物理状态分类: 用气体作流动相气相色谱 用液体作流动相液相色谱 固定相可以是液体或固体,便可组合成四种主要色谱类型: 气固色谱(gas-solid chromatography,GSC ) 气液色谱( gas-liquid chromatography ,GLC ) 液固色谱(liquid - solid chromatography ,LSC) 液液色谱( liquid - liquid chromatography ,LLC,2、按固定相的形态分类,(1)柱层析 (column chromat
3、ography) 固定相装在柱内即为层析柱,根据层析柱的尺寸,结构和制备方法不同,分为填充柱层析和毛细管或开管柱层析。 (2)平板层析(planar chromatography) 固定相呈平板状,包括薄层层析、薄膜层析和纸层析。固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板、塑料板或有机薄膜上,或将固定相直接制成薄板状,称为薄层层析(TLC);用滤纸作为固定相或固定相载体的层析为纸层析(PC)。,3、按分离过程物理化学原理分类,(1)吸附层析 (absorption chromatography) 用固体吸附剂作层析的固定相,利用样品各组分在吸附剂上吸附力的大小不同,而将各组分分离。如气固吸附层析和液固吸附层
4、析。 (2)分配层析 (partition chromatography) 用液体作固定相,样品组分(溶质)在固定相中溶解、吸附或吸着能力不同,因而在两相之间分配系数不同将样品组分分离。如气液分配层析,液液分配层析。在液液分配层析中,根据流动相和固定相对极性不同,又分为正相层析和反相层析。,正相分配层析 ( NPC) 一般以强极性、亲水性物质或溶液为固定相,非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相,称正相层析。 反相分配层析 ( RPC) 以非极性、亲脂性物质或溶液为固定相,以极性、亲水性溶剂或水溶液为流动相,称反相层析。,(3)离子交换层析 ion-exchange chromatography
5、(4)凝胶层析 gel chromatography (5)亲和层析 affinity chromatography,三、层析法的优点,生物大分子的特点:有多样性,以复杂的形式(混合物、复合物)存在,对环境如温度、pH 条件、离子强度的要求较高。 用于研究的样品要求:一定的质和量,保存生物活性和严格的构象。 层析法的优点 1、在室温下操作 2、流动相的pH 值可以与生理液相似 选用含盐的缓冲溶液或与水互溶的有机溶剂,3、柱填料的表面经各种相应化学修饰和覆盖,为生物大分子的分离提供了温和的条件和 “软接触” ,利于保持其原有的构象和生理活性。 4、样品量可多可少,可用于制备和分析。,第二节 吸附
6、柱层析,一、常用术语 1. 固定相:层析基质 2. 流动相:洗脱剂、展层剂 3. 层析:样品在固定相和流动相中连续多次进行分配、吸附或交换作用,最终使各组分得到分离。 4. 操作容量:在特定条件下,某种成分与基质反应达到平衡时,存在于基质上的饱和容量。一般以每克基质结合某种成分的mmol数或mg数表示。,5. 床体积:膨胀后基质在层析柱中所占有的体 积(Vt)。 6. 洗脱体积:某一成分从柱顶部到底部的洗脱液 中出现,浓度达到最大值时流动相的体积。 7. 膨胀度:单位重量的基质充分溶胀后所占有的 体积(V)。 8. 分配系数和迁移率,外水体积 Vo,洗脱体积 Ve,固定相,层析床,二、基本原理
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