基因克隆及克隆基因的表达.ppt
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1、吉林大学白求恩医学院 分子生物学教研室 讲 师 孙 巍 Tel: 0431 - 85619369 2012-10,基因克隆、 克隆基因的表达,,荧光蛋白基因克隆猫,科学家复活冰冻死老鼠,修正基因蚊子防控疾病,基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛,基因克隆胚芽造就健康婴儿,基因克隆趣闻,,荧光蛋白基因克隆猫,具有荧光蛋白基因的克隆猫在紫外线照射下会变色,由韩国科学技术部公布的对比照片显示出3只具有荧光蛋白基因的克隆猫(上图为普通光线照射下,下图为紫外线照射下),,科学家复活冰冻死老鼠,一只老鼠死亡后被冷冻了16年之久,日本科学家从其体内提取基因克隆了一只新老鼠,这是人类首次成功克隆冷冻动物。,,修正基因蚊
2、子防控疾病,科学家把一种可防疟疾的基因植入蚊子基因之中,对蚊子基因进行修正。 在实验中,科学家们不仅仅在蚊子体内植入了防疟疾基因,还植入了另一种可以使蚊子眼睛发出荧光的基因。这样,科学家就可以很容易识别它们。,,基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛,2007年,英国科学家在实验室中利用基因转换技术成功地在蝌蚪头部培育出第三颗眼球。这个消息对盲人来说是一个天大的喜讯。利用这种技术,干细胞科学家们真的有可能实现他们再造眼球的梦想。,,基因克隆胚芽造就健康婴儿,基因的秘密随着科技的日益发达而被逐渐揭开。血友病、色盲、白化病这些遗传病困扰着一个又一个家庭,也激励着一代又一代科学家为之奋斗。,,分子生物学关键的技
3、术突破: DNA重组技术,1972年, 世界上第一个重组DNA分子诞生,Paul Berg a biochemistry at Stanford,1980年, 获诺贝尔化学奖,,克隆:通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。,基因克隆: 是指来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接,构建成新的重组DNA,然后送入受体生物中去表达,从而产生遗传物质转移和重新组合。,,一、目的DNA的分离获取(分);,二、载体的选择与准备(择);,三、目的DNA与载体连接(接);,四、重组DNA转入受体细胞(转);,五、重组体的筛选与鉴定(筛)。,DNA克隆的过程包括五个基本部分:,
4、,一、目的DNA的分离获取(分),分离获取目的DNA有多种方法:,(一) PCR待扩增目的基因两端序列已知(据此设计引物),(二) 基因文库先构建,后筛选,(三)化学合成法直接合成目的DNA(序列已知、片段较短),,随机打碎:,缺点:难以重复;获得的DNA量少等。,,限制性核酸内切酶的发现,1970年, 第一个限制性核酸内切酶,定点剪切DNA,操作DNA,1978年, 获诺贝尔生理学或医学奖,限制性核酸内切酶用于切割DNA,,限制性核酸内切酶 Restriction endonuclease,可分为、型,分子生物学中通常使用的是型:,能在DNA双链内部的特异位点识别并切割DNA,“分子剪刀”,
5、+,Bam H,核酸水解酶,裂解磷酸二酯键。,,型限制性内切酶具有一些共性和特性:,1. 具有特定的识别和切割位点,II型限制性内切酶的识别位点举例(示切割位点),识别位点通常为6或4碱基序列,,2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构(palindrome),两条核苷酸链中,从5到3方向的核苷酸序列完全一致,型限制性内切酶具有一些共性和特性:,,3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端,Bam H,+,Hind,+,平端切口,黏端切口,(sticky end),(blunt end),型限制性内切酶具有一些共性和特性:,,粘性末端又可分为两种:,1)5-端突出,2)3-端突出,,4. 不同的酶可
6、以产生同样的末端,同尾酶(isocaudarner): 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA后,产生相同的黏端,这样的酶彼此互称为同尾酶。这两个相同的黏端称为配伍末端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,互连后?,型限制性内切酶具有一些共性和特性:,,5. 不同的酶可以识别同一个序列,同工异源酶(isoschizomer)或同裂酶 能识别同一序列(切割位点可同或不同)但来源不同的两种酶。,+,Bam H,+,Bst,为DNA操作增加了酶的可选余地,型限制性内切酶具有一些共性和特性:,,6. 切割会受其他因素的影响,通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲
7、基化的序列。 缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。,如,EcoR I在正常情况下识别“-GAATTC-”序列,但在甘油浓度大于5%(v/v)或反应温度较低时识别序列可变为“-AATT-”或“-嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶-”,这种现象称为星号活性(star activity),以EcoR I*表示。,型限制性内切酶具有一些共性和特性:,,M,6. 切割会受其他因素的影响,5.不同的酶可以识别同一个序列,4. 不同的酶可以产生同样的末端,3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端,2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构(palindrome),1. 具有特定的识别和切割位点,型限制性内切酶具有一些共性和
8、特性:,在DNA双链内部的特异位点识别并切割DNA,,文库法:,一个细胞只接受一个重组DNA分子,一般一个载体只携带一段外源DNA,单克隆,,基因组DNA文库(genomic DNA library): 包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克隆群体,以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息。,如何从文库中钓取基因?,,用带有标记的、已知序列的核酸片段 (单链RNA或DNA)作为探针,与待测DNA或RNA 样品进行核酸分子杂交,来检测被测样品中是否有与探针序列同源的目标序列,以及目标序列的量。,,转膜、 变性、 封闭、 加入变性的探针、 杂交、 洗涤、 检测杂交体。,,如何实
9、现特异性的获得目的基因?,,聚合酶链式反应,Polymerase Chain Reaction, PCR,体外高效特异性的扩增目的DNA片段,,,,,,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,,94,55,37,,Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,,72,94,55,PCR循环,,PCR的基本原理,PCR反
10、应条件 PCR过程 PCR的特点,,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,
11、模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,,PCR Primer Design,PCR反应中有两条引物,即5引物和3引物。,5,5,3,3,5,5,First cycle,ATG TAA,3,3,Target sequence,上游引物、5 引物、Sense primer,引物设计的总原则提高引物与模板结合的特异性。,PCR反应扩增的就是一对引物之间的DNA片段,PCR反应成功扩增的关键在于引物的正确设计。,,PCR引物设计的基本原则:,1.引物与模板的序列要紧密互补。 2.引物自身、引物之间不应存在互补序列。 3.引物不能在模板的非目的位点引发PCR
12、。,, 长度:特异性序列一般15-18bp。 碱基分布: 引物方向:53 引物的3端:是DNA延伸的起点,一定要严格与模板DNA配对。 引物的5端:可以加非特异性序列,如酶切位点等。 同源性比较:引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。,PCR引物设计的具体方法:,尽量随机分布,避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象。GC比在45-55%。 3和5引物具有相似的Tm值。Tm=4(G+C)+2(A+T)。,,PCR引物的设计实例,已知IFN- cDNA序列如下, 该如何设计PCR引物?,,at gaaatataca agt,gaagagca tcccagtaa,atgaaatat
13、acaagt,3,5,3,5,上游引物结合,cttctcgtagggtcatt,下游引物结合,设计引物时: 特异性序列:5引物照抄,3引物互补倒读,即: 5引物与位于待扩增片段5上游的一小段DNA序列相同; 3引物与扩增片段3端的一小段DNA序列互补。 酶切位点加在引物的5;调GC含量的碱基放在最前边; 此外,无发夹结构、与基因组其它区域的同源性较差。,,,琼脂糖凝胶电泳 Agarose gel Electrophoresis,M,,二、载体的选择与准备(择);,载体(vector):携带外源DNA,实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,2.按基本元
14、件的来源,分类:,质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等,,二、载体的选择与准备(择);,(二)考虑目的DNA的大小及受体细胞的种类和来源,(三)含有合适的MCS,,克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖,(一)克隆载体(cloning vector)应具备的主要特点,1.至少有一个复制起点(origin of replication, ori) 2.至少有一个选择性标志(selection marker) 3.有适宜的限制性内切酶的单一切点:多克隆位点(multiple cloning sites,MCS) 4.应有较高的拷贝数,pBR322质粒图谱,,克隆载体用于外源D
15、NA的克隆和无性繁殖,(二)常用克隆载体的种类,1.质粒(plasmid)是最常用的克隆载体,广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中 独立于宿主细胞染色体外的环状双链的超螺旋结构 能在宿主细胞内独立自主复制 带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状 质粒的不相容性:两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。,,目前,已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择,可容纳10kb以内的外源DNA 。,pUC18/19质粒图谱,pUC18/19质粒,2686bp,是最常用的质粒载体 缺乏控制拷贝数的rop基因,因此其拷贝数达500-700,,T-载体:,,克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖,(二)常用克隆载
16、体的种类,2.噬菌体(phage),,克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖,(二)常用克隆载体的种类,3.穿梭载体(shuttle vector) 可在不同宿主细胞中应用,,表达载体用于外源DNA的表达,表达载体(expression vector):用来在宿主细胞中表达外源基因的载体 依据其宿主细胞的不同可分为: 原核表达载体(prokaryotic expression vector) 真核表达载体(eukaryotic expression vector),,三、目的DNA与载体连接(接),, 单酶消化的粘性末端连接:,连接效率高; 载体需去磷酸; 双向连入载体,,Vector,Sma
17、I,HeaIII,SmaI,RE digestion,RE digestion,Vector,Ligation, 平头末端连接:,连接效率低 双向连入载体 自身环化率高,, 双酶消化的粘性末端连接:,连接效率高; 定向连接.,, T-A粘性末端连接:,连接效率高 双向连入载体 自身环化率,,四、重组DNA转入宿主细胞进行扩增(转),宿主细胞,感受态细胞(competent cell): 处于易于接纳外源物质的状态的细菌,,转化(transformation) 质粒或黏粒细菌 质粒酵母(真核细胞) 转染(transfection) 外源DNA真核细胞(酵母除外) 感染(infection) 噬菌
18、体颗粒细菌 病毒颗粒哺乳细胞,几个相关概念:,,将重组DNA转入受体细胞的常用方法:,化学法: 氯化钙法 物理法: 电击法 显微注射法 等,,氯化钙化学转化法,,电击法,利用瞬间高压在细胞上打孔,,显微注射法,,连接产物,感受态细胞:E.coli,Ligation mixture,introduce plasmid into E.coli cells,Transfer onto agar plate,,筛选出含有重组DNA(目的基因+载体)的克隆,转化后的克隆群体:,,五、重组体的筛选与鉴定(筛),,五、重组体的筛选与鉴定(筛),细胞在含有相应抗生素的培养基中培养: 无载体转入的细胞dead;
19、含有载体的细胞alive。,1. 利用抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子,尚需进一步鉴定载体是否为含有目的DNA的重组载体,,IPTG,Blue-white screening of recombinants,半乳糖苷酶,Lac Operon ?,在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法,五、重组体的筛选与鉴定(筛),2. 蓝白筛选,,Blue colony,IPTG,蓝色吲哚产物,半乳糖苷酶,X-gal,Blue cell.,,如果外源基因插入位于LacZ基因内部的多克隆酶切位点,则不能通过-互补编码-半乳糖苷酶,菌落呈白色。,-互补,菌株带有-半乳糖苷酶C端的编码序列 载体质粒带有-
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