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1、工具酶,载体,和,第四章 工具酶 工具酶 基因工程技术中能用于DNA和RNA 的合成、连接、切割和修饰的各种酶。 包括: 限制酶,核酸酶.聚合酶, 连接酶, 激酶, 磷酸酶,第一节 限制性内切酶 (Restriction Endonuclease) 一. 细菌的限制一修饰现象被发现 瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论: 核酸内切酶降解细菌外源DNA, 修饰酶保护自身DNA Arber首次从 E.Coli B菌株中分离出型限制酶EcoB 美Hopkings大学 H.Smith 从流感嗜血菌中分离 型 限制酶 Arber, Smith获得1978 年Nobel奖,二.限制酶系统分类和
2、命名 1985年后大量限制酶被发现,已从350多种微生物中发现2000多种限制酶,识别108种不同的特定序列 限制性内切酶的分类 型: 特异识别、随机切割 型:特异识别、同点切割 型:特异识别、异地切割 通常所指的限制酶即类酶,限制酶特性比较 I型 II型 III型 限制与修饰由 同一酶承担 是 否 是 酶反应辅助因子 ATP.mg+ SAM mg+ ATP.mg+SAM 识别位点特性 / 4-6bp回文对称 / 切割位点 距离1kb 识别点中 距3端24-26bp 举例 EcoB BamHI EcoPL 识别位点 TGAN8TGCT G GATTC AGACC 克隆工作中用途 无 有 无 S
3、AM: 硫一腺苷甲硫氨酸,三.系统命名法 限制性内切酶的命名方法 属名 种 变种 序数 1字母 2字母 1字母 (EcoRI) E co R I (HindIII)H in d III (BamHI) B am H I,四.一般限制酶的识别特点 1. 大多数是严格的识别顺序,少数可变 2. 识别顺序的碱基数一般为4-6 bp,少数识别更长 3. 多数识别位点具有旋转对称性,少数的识别位 点在切割位点之外,具旋转对称性,4bp Hpa C CGG Hae GG CC 5bp Ava G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamH G GATTC Sma CCC GGG 11bp Bg1 G
4、CCNNNN NGGC 12bp BstX CCANNNNN NTGC N=A, T, G, C,五. 限制酶的切割末端 5粘端 (EcoR I) 3粘端 (Pst I) 平端 (Sma I) 六.限制酶产生的末端的连接 1. 匹配粘端: 直接连接 2. 平末端: 万能连接 3. 不匹配粘端: S1 Nuclease切去突出端 或Klenow补平,七.识别位点与切割方式之间的关系 1.识别不同,切割不同 eg: BamHI EcoRI -G GATC C- - A GATCT- -C CTAG G- - T CTAG A- 2.识别不同,切割产生末端相同(同尾酶) eg: BamHI Bg1
5、- A GATCT -G GATCC - T CTAG A -CCTAG G,3.识别相同,切割不同 eg: SmaI XmaI -CCC GGG- -C CCGG -GGG CCC- -G GGCC C- 4识别相同,切割相同同工酶 同裂酶 eg: Hpa Msp -CCGG- -C * C GG- -GG CC- -G G CC-,八.限制酶反应的影响因素 1. 温度:一般37C,有例外,如:SmaI 25C, BclI 50C,TaqI 65C 2. 缓冲液:高、中、低盐之分 (NaCl) 3. 时间:1-1.5小时 4. 反应体积和甘油浓度:酶1/10体积 5. DNA纯度与构型:,(
6、1)纯度:RNA,蛋白,氯仿,SDS,EDTA, EB,酚,乙醇,硫酸根,DNA (2)构型:切超螺旋需更多的酶 例: lg DNA, EcoRI 切, 1U 超螺旋 pUCl9, EcoRI 2.5U Hind 5U Sal I 10U Nar I 20U,酶单位的定义: 1U:50ul反应体积中,1小时内酶完全切割 1ug DNA所需要的酶量 缓冲液 NaCl 0, 50, 100mmol/L离子强度 Tris-HCl pH7.5-8.0 MgCl2 激活因子 DTT 保护还原性基因,近末端的切割: eg: AccI GGTCGACC 切不动 CGGTCGACCG 切不动 CCGGTCGA
7、CCGG 切不动 eg: EcoRI GGAATTCC CGGAATTCCG 2小时内90%完全酶切 eg: PmeI GTTTAAAC 20小时不能切 GGTTTAAACC 20小时,25%切开 GGGTTTAAACCC 20小时,50%切开 AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG 20小时, 90%切开,星号反应(Star Activity) 识别专一性下降 eg: EcoRI GAATTC EcoRI* AATT 原因:甘油浓度过高,酶浓度太大, 离子强度不适,pH不适(Ph8.0) 存在有害试剂(1%乙 醇, DMSO, 乙二醇) 阳离子变化:Mn+, Co+, Zn+, Cu
8、+代替mg+,酶的灭活,1.加热 2.酚抽提,第二节 修饰酶 一.分类 细菌DNA聚合酶 *E. Coli DNA聚合酶(全酶) *Klenow酶 T4噬菌体DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶 *测序酶(修饰的T7 pol) *Taq DNA聚合酶 *反转录酶 末端脱氧核苷酸转移酶 依赖于DNA的RNA聚合酶 SP6噬菌体RNA聚合酶 T3噬菌体RNA聚合酶 T4噬菌体RNA聚合酶,连接酶 E. Coli DNA连接 *T4 DNA连接酶 T4噬菌体 RNA连接酶 激酶 T4噬菌体多核苷酸激酶 磷酸酶 *碱性磷酸酶 核酸酶 Ba131核酸酶 S1核酸酶 绿豆核酸酶 RNaseA RNaseT
9、1 DNaseI EXo 噬菌体外切核酸酶,二.聚合酶 1. E. Coli DNA聚合酶 活性:(1)53DNA聚合酶活性 (2)35核酸外切酶活性 (3)53核酸外切酶活性 主要用途:切口平移法标记DNA,2. Klenow酶 枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解 E. Coli DNA聚合酶得到的该酶的大片段 活性:(1)53聚合酶活性 (2)35外切核酸酶活性 主要用途: (1)补平3凹端 (2)补平3凹端,末端标记 (3)合成cDNA第二链 (4)体外诱变中从模板合成DNA第二链,3. T4 噬菌体DNA聚合酶 活性:(1)53聚合酶活性 (2)35外切核酸酶活性, 比 Klenow 酶强2
10、00倍 用途: 3突出端切平 4. T7噬菌体DNA聚合酶 活性: 53聚合酶活性很强, 无35外切核酸酶活性 主要用途:修饰后用于测序 5. Taq酶 耐热(75-80 C)的DNA聚合酶专用于PCR,6.逆转录酶: AWV (源于鸟成髓细胞白血病病毒), Mo-MLV(源于Moloney鼠白血病病毒) 活性: (1)53聚合酶活性 (2) RNaseH活性(Mo-MLV 小,cDNA得率高) 主要用途: (1)反转录cDNA (2) 标记5突出端(补平) (3) 测序,7.末端转移酶 作用:在DNA或RNA3羟基上加dNTP 主要用途:(1)载体或cDNA加同聚尾(100nt) (2)DN
11、A的3OH同位素标记 三. 激酶 T4多聚核苷酸激酶 催化ATP的 -磷酸基到DNA或RNA的5 OH 主要用途: DNA的5OH同位素标记 (寡核苷酸),四.连接酶 T4 DNA连接酶 连接:粘端,平端,dsDNA中的切口, 杂交体连接 五.碱性磷酸酶 包括细菌碱性磷酸酶(BAP)和小肠碱性磷酸酶(CIP), 虾碱性磷酸酶(SAP) 用途: 去除DNA、RNA、NTP、dNTP的5磷酸根,六.核酸酶 1.DNA酶 为DNA内切核酸酶,水解单链或双链 用途:(1)缺口平移标记探针时产生随机切口 (2)降解DNA 2.RNA酶 内切核糖核酸酶,专用降解RNA,3. S1核酸酶 作用:降解单链DNA或RNA(酶量小) 降解双链DNA(酶量大) 用途:(1)去除DNA突出端,切为平头 (2)打开cDNA发夹结构 4.外切核酸酶III(ExoIII) 作用:从双链 DNA3OH 逐一降解单核苷酸 不降解单链DNA或3突出的从双链DNA 用途:系列缺失亚克隆,
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