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1、1,基 因 工 程 GENE ENGINEERING,主讲教师: 周国利 E-mail: ,2,Chapter 7 克隆基因的表达,3,Chapter 7 克隆基因的表达,第一节 基因表达的基本过程 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 第三节 外源基因在真核细胞中的表达,4,第一节 基因表达的基本过程,基因组(genome) 一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因。 基因表达(gene expression) 基因表达是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译,产生有生物活性的蛋白质的过程。,5,第一节 基因表达的基本过程,6,一、
2、基因表达的基本规律,(一)时间特异性 按功能需要,某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生,称之为基因表达的时间特异性(temporal specificity). 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性(stage specificity).,7,一、基因表达的基本规律,(二)空间特异性 在个体生长全过程中,某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现,称之为基因表达的空间特异性(spatial specificity). 基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异,实际上是由细胞在器官上的分布决定的,所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificit
3、y).,8,二、基因表达的方式,基因分类 管家基因:表达很少受环境因素影响。 可调节基因:受环境因素的诱导或阻遏(可诱导或可阻遏)。,9,二、基因表达的方式,按对刺激的反应性,基因表达的方式分为: (一)组成性表达 某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达,通常被称为管家基因(housekeeping gene),10,二、基因表达的方式,无论表达水平高低,管家基因较少受环境因素影响,而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达,或变化很小。区别于其它基因,这类基因表达被视为组成性基因表达(constitutive gene expression). 如微管蛋白基因、糖酵解系基因与
4、核糖体蛋白基因等。,11,二、基因表达的方式,(二)诱导和阻遏表达 在特定环境信号刺激下,相应的基因被激活,基因表达产物增加,这种基因称为可诱导基因。 可诱导基因在特定环境中表达增强的过程,称为诱导(induction) 如果基因对环境信号应答是被抑制,这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression),12,三、基因表达调控的生物学意义,(一)适应环境、维持生长和增殖 (二)维持个体发育与分化,13,四、基因表达调控的基本原理,(一)基因表达的多级调控 DNA水平: 基因丢失;基因扩增;基因重排;甲基化修饰;染色质的结构状态 RNA水平: 转录水平调控;R
5、NA的转录后加工; mRNA从核内向胞浆转运;mRNA稳定性 蛋白质水平: 翻译过程;翻译后加工;蛋白质的稳定性,14,四、基因表达调控的基本原理,(二)基因转录激活调节基本要素 1、特异的DNA序列:如启动序列,操纵序列,Pribnow盒,GC序列等。 2、调节蛋白:如阻遏蛋白,激活蛋白,CAP,转录因子等。 3、DNA-蛋白质,蛋白质-蛋白质相互作用 4、RNA聚合酶,15,五、 基因表达的基本过程,外源基因在宿主细胞中的表达,16,思考?,基因表达与克隆基因表达的异同? 提示:从表达的对象、过程和场所等考虑。,17,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,用原核生物作宿主,18,第二节 外源
6、基因在原核细胞中的表达,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势: 1、全基因组测序,共有4405个开放阅读框架 2、基因克隆表达系统成熟完善 3、繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 4、被USA FDA批准为安全的基因工程受体生物,19,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,大肠杆菌表达外源基因的劣势: 大肠杆菌中的表达不存在信号肽,产品多为胞内产物,提取困难。 因分泌能力不足,真核蛋白质常形成不溶性的包含体,表达产物需经变性复性才恢复活性。 蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。 其内毒素很难除去。,20,一、原核生物基因表达的特征,1、只有一种RN
7、A多聚酶 识别原核细胞的启动子,催化所有的RNA合成。 2、以操纵子为单位 数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。,21,乳糖操纵子的结构,22,一、原核生物基因表达的特征,3、转录和翻译偶联、连续进行,23,一、原核生物基因表达的特征,4、不含内含子,缺乏转录后的加工系统。 5、调控主要在转录水平上。 6、mRNA的核糖体结合位点:Shine-Dalgarno(SD) sequence 在起始密码子上游约47个核苷酸之前还有一段富含嘌呤的5AGGAGG3短小序列,它可以与16SrRNA3端的3UCCUCC5区段完全互补。mRNA上的这段序列称为ShineDalgarno序列
8、(简称SD序列)。,24,二、原核表达系统的注意事项,1、外源基因不能带有内含子 2、必须用cDNA 3、不能直接用真核基因组DNA 4、必须利用原核细胞的调控原件(启动子等) 5、防止外源基因产物对宿主细胞的毒害,25,三、原核生物基因表达的调控,大肠杆菌基因表达载体的基本结构特征,26,三、原核生物基因表达的调控,1、启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 (1)启动子序列 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序(consensus sequence): -35box and -10 box.,27,28,三、原核生物基因表达的调控,-35box: RNA聚合
9、酶亚基的识别位点。 5-TTGACA-3 -10box(pribnow box) 5-TATAAT-3,29,原核启动子共有序列的功能,30,三、原核生物基因表达的调控,(2)翻译的起始位点 核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS) 1) SD sequence: mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。,31,三、原核生物基因表达的调控,2)起始密码 位于SD序列下游 AUG (91%) GUG (8%) UUG (1%),32,三、原核生物基因表达的调控,3)RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA, rRNA and mRNA. 结构:
10、全酶是一个5聚体,含有两个小亚基和两个大亚基(和),一个亚基。,33,三、原核生物基因表达的调控,4)转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子 E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序,其后紧接一串A,称为内终止子,形成终止信号。,34,终止 形成的原因, 茎环结构 反向回文顺序被转录后,立即形成一个茎环结构,使转录物与模板之间配对的碱基数降低,整个减弱了RNA与DNA的互作。 多聚A/U 由于茎环3端紧接一串A/U的配对,稳定性比较差,有利于转录物脱落而不利于转录延续。,35,终止原因示意图,36,三、原核生物基因表达的调控,5) 翻译终止密码 大肠杆菌偏爱
11、UAA. 一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃(skipping)。 6) 翻译增强子(translation enhancer) 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。 T7噬菌体基因10前导序列(简称g10-L序列);大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的区段。,37,三、原核生物基因表达的调控,7) 基因工程常用的原核启动子 最佳启动子必须具备的条件 必须是一种强启动子:能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。 应呈现低水平的基础转录:便于表达毒性蛋白等。 应是可诱导型的:用温度或化学试剂诱导。,38,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部
12、位,1、细胞质中表达 (1)包涵体(Inclusion body) 是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。 形成原理未知! 优点:使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 缺点:回收的蛋白生物活性差 如:human Growth Hormone, hGH,39,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,2、周质中表达 (1)周质(periplasm) 格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚。 优点:容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。,40,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,3、胞外表达 使在
13、大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。 用溶血素(hemolysin)基因构建分泌性融合蛋白; 或与细菌素释放蛋白(bacteriocin release protein)共表达。 由于需要穿过两层膜,大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中,效果都不太理想。,41,大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白的优缺点,42,五、几种类型的原核表达载体,1、非整合型表达载体 载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。 优点:产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点:容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。,43,举例:Pkk223-3载体,哈佛大学的GILBERT实验室建立的。表达能
14、力强。组成结构如下: 强启动子: tac(trp-lac): trp的-35区-lacUV5的-10区 操纵基因:乳糖操纵子系统,lac操纵基因。,44,举例:Pkk223-3载体, 调节基因:宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统,如JM105菌,LacI. 终止子:rrnB的强终止子。 SD序列和插入位点区:SD-插入位点区,45,举例:Pkk223-3载体, 载体的其余部分:来自pBR322质粒 表达诱导物:IPTG,46,举例:Pkk223-3载体,47,五、几种类型的原核表达载体,2、分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连接在一起,可被宿主菌分泌到细胞周质中。如pIN I
15、II系列。,48,49,2、分泌型表达载体,(1)组成结构 强启动子:Ipp(脂蛋白基因启动子)和lacUV5启动子 调节基因:lacI SD序列和起始密码ATG 分泌信号肽:大肠杆菌外膜蛋白基因ompa 插入位点区(MCS),50,2、分泌型表达载体,51,五、几种类型的原核表达载体,3、融合蛋白表达载体系统-pGEX系列 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 (1)优点:便于融合蛋白的分离和纯化。 (2)组成结构:启动子,操纵基因,调节基因,SD序列,ori,融合肽(GST),52,五、几种类型的原核表达载体,(3) 产物提纯 GST融合蛋白用glutathion
16、e sepharose 亲和层析柱分离纯化。 (4)产物分离 用凝血酶或Xa因子可以所外源蛋白从GST上切下来。,53,五、几种类型的原核表达载体,(5) 其它融合蛋白系统 在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸(His)。 His-tag能与Ni2+柱结合,但很容易被EDTA洗脱下来,可以纯化蛋白质。,54,55,六、影响外源基因表达效率的因素,1、启动子的结构对表达效率的影响 (1) 一致顺序:-35box(5TTGACA3) and -10box(5TATAAT3) (2) -35box and -10box之间的距离:间隔为17bp时,启动子最强。 (3) -35box and -10b
17、ox区的碱基顺序:越接近一致顺序,启动子越强。,56,57,六、影响外源基因表达效率的因素,2、转译起始序列对表达效率的影响 (1) SD序列 SD序列与16srRNA分子之间的碱基互补程度,可明显地影响mRNA的转译速率。当序列为5GGAGG3, 可与16srRNA 3端完全互补,转译效率最高,而当该序列发生单碱基突变时,转译效率会下降30倍。 SD序列后面的4个碱基,如果是A(T),翻译效率最高;如果是G(C),效率只有50%或25%。,58,六、影响外源基因表达效率的因素,(2) 起始密码AUG AUG左侧的三个碱基也有影响。 -半乳糖苷酶的mRNA中:AUG左侧如果是UAU或CUU时,
18、最为有效; 如果是UUCUCA或AGG时下降20倍。 AUG右侧的三个碱基也有影响。,59,六、影响外源基因表达效率的因素,(3) 其它 多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。 噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核糖体结合位点有多个U,60,六、影响外源基因表达效率的因素,3、启动子与外源基因之间的距离,61,六、影响外源基因表达效率的因素,4、转录终止区对表达效率的影响 转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因,不必浪费原料和能量、不会干扰正常的表达。 5、载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响 增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目,增加表达效率。但过度的外源基因的
19、表达会影响宿主的正常生长。 6、外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响,62,七、提高表达水平常用的方法,1、选择强启动子序列 如tac等 2、调整SD序列与AUG碱基的距离 一般为5-9bp。距离过长或过短都影响真核基因的表达,根据不同的启动子选择不同的距离。 3、改变起始密码下面的几组密码子 能提高翻译的起始效率。,63,七、提高表达水平常用的方法,4、增加mRNA的拷贝数和稳定性 在外源基因的下游插入“重复性基因回文序列”能防止mRNA 受到3-5外切酶攻击。,64,七、提高表达水平常用的方法,5、减轻宿主细胞的代谢负荷 合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。 (1)诱导表达:将
20、宿主生长代谢与外源基因表达分开,一般采用温度诱导或药物诱导。如药物诱导弄(tac启动子),有无IPTG. (2)表达载体诱导复制:将宿主的生长与载体的复制分开。 当需要宿主大量生长时,抑制载体的复制;当宿主大量生长后,再诱导载体质粒的复制,增加拷贝数。,65,七、提高表达水平常用的方法,6、提高表达产物的稳定性 防止被宿主的酶降解。 (1) 设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。 N末端:由原核基因编码一段多肽 C末端:是完整的真核外源基因。,66,七、提高表达水平常用的方法,(2) 使用突变菌株,保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。 (3) 表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条
21、件 有信号肽:位于N端,一般为15-30aa。真核与原核的结构相似,功能相似,可以互换。,67,七、提高表达水平常用的方法, 蛋白质内有与分泌相关的AA序列, 为蛋白质指明目的地。 细胞内的转运机制 信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。 真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达;但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。,68,八、细菌表达载体举例,69,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,1、形成正确的二硫键 分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。,70,人胰岛素分子,71,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,2、前体切割 如信号肽、内含肽(intein)
22、等序列的切割,72,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,3、蛋白质糖基化 增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质 (1) 0-糖基化(Ser, Thr) (2) N-糖基化(Asn),73,十、原核细胞表达的缺陷,1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统,如糖基化、氨基酸修饰等。 2、原核表达外源蛋白常以包涵体形式存在,必须经过变形、复性处理才能获得有生物活性的蛋白,并且表达量非常低。 3、原核细胞中表达的真核蛋白不稳定,容易被细菌蛋白酶降解。,74,十、原核细胞表达的缺陷,4、原核细胞没有转录后加工系统,无法识别内含子,故原核细胞无法表达没有加工过的真核基因组。 5、重组原核细胞在培养过程中产生的毒素难以排
23、除,污染表达产物,影响产品纯度。,75,第3节 外源基因在真核细胞中表达,76,一、真核生物表达概述,1、真核生物表达的优越性和必要性 2、真核生物的基因结构 3、真核生物的表达调控特点 4、真核生物的表达调控模式,77,1、真核生物表达的优越性和必要性,1)真核生物具有转录后加工系统,可识别并删除基因中的内含子,剪切加工为成熟mRNA. 2)具备完善的翻译后加工系统,可进行糖基化、乙酰化等修饰,使蛋白形成正确的天然构型,因而真核生物表达系统产生的蛋白更接近天然状态,有利于其功能、生物活性的研究。 3)某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中,简化了纯化工艺,降低了生产成本。 另外,由于
24、真核生物表达调控方式非常复杂,有助于我们深入了解基因调控的机制。,78,2、真核生物的基因结构,1)真核生物中DNA极其非富:大肠杆菌基因组为4x106bp, 哺乳动物基因组为109bp. 如此丰富的基因组中克隆、筛选出某一目的基因就比较困难。,79,2、真核生物的基因结构,2)真核生物基因的不连续性: 3)真核生物mRNA5端有帽子结构,3端有polyA尾巴。,80,2、真核生物的基因结构,4)真核生物基因组中含有大量的重复序列 高度重复序列,中度重复序列,单拷贝序列 功能: 编码一些功能十分重要、需要量极大的产物,如组蛋白,tRNA、rRNA等。 重复序列中含有特殊结构,参与基因表达调控。
25、如AT含量丰富,易解链,有利于与调控基因复制的蛋白相结合。 与染色体构象、着丝点形成有关。,81,3、真核生物的基因表达调控特点,1)真核生物基因表达调控是多方面、多层次的 A: 真核生物DNA多与组蛋白形成复杂的高级结构,被包裹在核膜内,而核外(如线粒体DNA)等,这就增加了基因表达的层次性和复杂性。 B:,82,3、真核生物的基因表达调控特点,2)一条成熟mRNA只能翻译出一条单一肽链,而不能形成原核生物的多顺反子。 3)真核生物中转录和翻译在时间和空间上都是完全分开的,其功能相关基因分开,分别进行转录和翻译,而没有操纵子式的结构。,83,4、真核生物的基因表达调控模式,84,4、真核生物
26、的基因表达调控模式,1)转录前(基因组)的调控 即基因结构上的改变,较稳定长久,包括基因丢失、基因重组、基因扩增、甲基化修饰等。 2)转录水平的调控 RNA聚合酶:真核生物共有三种RNA聚合酶,分别合成不同类型的RNA,其中RNA聚合酶II转录合成mRNA.,85,4、真核生物的基因表达调控模式,2)转录水平的调控 A、顺式调控因子(cis-acting factor) 定义:与结构基因串联的特定DNA序列,对基因转录的精确起始和转录活性表重要作用。,86,4、真核生物的基因表达调控模式,2)转录水平的调控 正调控元件 i)启动子:真核生物启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件,至
27、少包括一个转录起始位点以及一个以上的功能组件。,87,4、真核生物的基因表达调控模式,ii) 启动子的结构特点 大小:真核200bp(原核60bp) 核心启动子:30区,TATA盒,7-10bp控制转录起始的准确性及频率。由TATA盒及转录起始位点即可构成最简单的启动子。 CAAT盒、GC盒(这两种序列不是必备,可缺1或缺2或顺序互换),提高转录效率。 所以,启动子包括至少一个转录起始位点及一个以上的功能组件。,88,4、真核生物的基因表达调控模式,iii) 增强子(enhancer) 指远离转录起始位点、决定基因的时间、空间特异性、增强启动子转录活性的DNA序列。 结构特点:由很多功能组件组
28、成。 作用特点:与距离无关,可远距离作用;无严格的专一性;没有方向性。 从功能上来说,没有增强子存在,启动子通常不能表现活性;没有启动子时,增强子也无法发挥作用。,89,负调控元件,i)沉默子(silencer) 双叫衰减子,是一类抑制基因转录的顺式调控因子,其作用方式与增强子相同:其作用不受序列方向的影响,也能远距离发挥作用,并对异源基因的表达起作用。,90,负调控元件,ii)转录终止信号 作用为抑制基因转录的结束。大多数真核基因mRNA3端有polyA尾巴,其上游10-20bp处具有加尾信号(AATAAA, ATTAAA), polyA下游有G/T簇。加尾信号和G/T簇共同构成这些基因的转
29、录终止信号。,91,2)转录水平的调控,B)反式调控因子(trans-acting factor) 由位于不同或相同染色体上相距较远的基因所编码的蛋白因子,通过与顺式调控元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因的转录活性。反式作用因子结构包含一个DNA结合的区域和转录活化结构域,DNA结合靠它特有的结构与相应的DNA序列结合,激活转录活化结构域,参与基因表达调控。,92,3)转录后修饰,包括mRNA的剪切,内含子的去除,外显子的拼接及mRNA的加尾和加帽。加尾和加帽均可增加mRNA的稳定性,延长其寿命;另外,加尾帮助mRNA进入细胞质,加帽则是核糖体结合和翻译起始所必需的。,93,4)翻译水平的调控,主要涉及mRNA, tRNA,核糖体和可溶性蛋白因子。 5)翻译后水平调控 蛋白质合成后,还必须经过一系列加工过程才能成为有生物活性的功能蛋白,包括切除信号肽,进行乙酰化和糖基化等化学修饰。,94,二、真核生物表达系统(自学),1、 在酵母中表达 2、昆虫培养细胞表达系统 3、外源基因在植物中表达 4、在哺乳动物细胞中表达,
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