微生物生长繁殖五 (2).ppt
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1、第五章 微生物的生长,繁殖与生存因子,生物个体物质有规律地、不可逆增加,导致个体 体积扩大的生物学过程。,生长:,生物个体生长到一定阶段,通过特定方式产生新的 生命个体,即引起生命个体数量增加的生物学过程。,繁殖:,生长是一个逐步发生的量变过程, 繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。,在高等生物里这两个过程可以明显分开,但在低等特别是在单 细胞的生物里,由于细胞小,这两个过程是紧密联系又很难划 分的过程。,第一节 微生物的生长繁殖,一个微生物细胞,合适的外界条件,吸收营养物质,进行代谢。,如果同化作用的速度超过了异化作用,个体的生长 原生质的总量(重量、体积、大小)就不断增加,如果各细胞组分
2、是按恰当的比例增长时,则达到一定程度后就 会发生繁殖,引起个体数目的增加。,群体内各个个体的进一步生长,群体的生长,一、微生物生长的测定:,单位时间里微生物数量或生物量(Biomass)的变化,微生物生长:,微生物生长的测定:,个体计数 群体重量测定 群体生理指标测定,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响;,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果;,客观地反映微生物生长的规律;,(一)以数量变化对微生物生长情况进行测定,1、培养平板计数法,采用培养平板计数法要求操作熟练 、准确,否则难以得到正确的结果:,样品充分混匀;,每支移液管及涂布棒只能接触一个 稀释度的菌液;,同一
3、稀释度三个以上重复,取平均值;,每个平板上的菌落数目合适,便于 准确计数;,一个菌落可能是多个细胞一起形成,所以在科研中一般用 菌落形成单位(colony forming units, CFU)来表示,而 不是直接表示为细胞数。,2、膜过滤培养法,当样品中菌数很低时,可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样 品通过膜过滤器,然后将将膜转到相应的培养基上进行培养,对形 成的菌落进行统计。,3、The most probable number method(液体稀释法),主要适用于只能进行液体培养的微生 物,或采用液体鉴别培养基进行直接 鉴定并计数的微生物。,对未知样品进行十倍稀释,然后根据估算取三
4、个连续的稀释度 平行接种多支试管,对这些平行试管的微生物生长情况进行统 计,长菌的为阳性,未长菌的为阴性,然后根据数学统计计算 出样品中的微生物数目。,4、显微镜直接计数法,1)常规方法:,缺点: 不能区分死菌与活菌; 不适于对运动细菌的计数; 需要相对高的细菌浓度; 个体小的细菌在显微镜下难以观察;,2)其它方法:,将已知颗粒浓度的样品(例如血液)与待测细胞细胞浓度的样品混匀 后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。,比例计数:,过滤计数:,当样品中菌数很低时,可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品 通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色,并经处理使膜透明,再在显 微镜下计算
5、膜上(或一定面积中)的细菌数;,活菌计数:,采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数,(二)以生物量为指标测定微生物的生长,1、比浊法,在一定波长下,测定菌悬液的光密 度,以光密度(optical density, 即O.D.) 表示菌量。,实验测量时应控制在菌浓度与光密度 成正比的线性范围内,否则不准确。,2、 生理指标法,微生物的生理指标,如呼吸强度,耗氧量、酶活性、 生物热等与其群体的规模成正相关。 样品中微生物数量多或生长旺盛,这些指标愈明显, 因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量 热计等设备来测定相应的指标。,常用于对微生物的快速鉴定与检测,二、细菌的群体生长繁殖,
6、微生物的特点:,个体微小,肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个 单个的微生物组成的群体。,微生物接种是群体接种,接种后的生长是微生物群体繁殖生长。,对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础,一、生长曲线,生长曲线(Growth Curve):,细菌接种到定量的液体培养基中,定时取样测定细胞数量, 以培养时间为横座标,以菌数为纵座标作图,得到的一条反映细 菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,在微生物学中提到的“生长”,均指群体生长。,细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图,一条典型的生长曲线至少可以分为 迟缓期,对数期,稳定期和衰亡期等四个生长时期,迟缓期(Lag phase):
7、,将少量菌种接入新鲜培养基后,在开始一段时间内菌数不立即增加, 或增加很少,生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。,迟缓期的特点:,分裂迟缓、代谢活跃,细胞形态变大或增长,例如巨大芽孢杆菌,在迟缓期末,细胞 的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞 体积最大 细胞内RNA,尤其是rRNA含量增高,合成代谢活跃,核糖体、 酶类和ATP的合成加快,易产生诱导酶。 对外界不良条件反应敏感。,细胞处于活跃生长中,只是分裂迟缓 在此阶段后期,少数细胞开始分裂,曲线略有上升。,对数生长期(Log phase):,又称指数生长期(Exponential phase) 以最大的速率生长和分裂,
8、细菌数量呈对数增加, 细菌内各成分按比例有规律地增加,表现为平衡生长。 对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致,代谢旺盛、生长 迅速、代时稳定,所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作 种子,使微生物发酵的迟缓期缩短,提高经济效益。,稳定生长期(Stationary phase):,由于营养物质消耗,代谢产物积累和pH等环境变化,逐步不适宜 于细菌生长,导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等 于细菌死亡数)。,稳定生长期又称恒定期或最高生长期,此时培养液中活细菌数 最高并维持稳定。,衰亡期(Decline或Death phase):,营养物质耗尽和有毒代谢
9、产物的大量积累,细菌死亡速率超过新生 速率,整个群体呈现出负增长。 该时期死亡的细菌以对数方式增加,但在衰亡期的后期,由于部分 细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低,仍有部分活菌存在。,二、同步培养,同步培养(Synchronous culture):,使群体中的细胞处于比较一致的,生长发育均处于同一阶 段上,即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。,以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段,并同时 进行分裂的生长。,同步生长:,通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物,硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法,由于细胞的个体差异,同步生长往往只能维持2-3个世代, 随后
10、又逐渐转变为随机生长。,三、连续培养,将微生物置于一定容积的培养基中,经过培养生长,最后一次收获。,分批培养(batch culture)or 封闭培养(closed culture),培养基一次加入,不予补充,不再更换。,连续培养(Continous culture ),在微生物的整个培养期间,通过一定的方式使微生物能以恒定 的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。,培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是 实现微生物连续培养的基本原则。,(一)恒浊连续培养,测定所培养微生物的光密度值,自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速,使培养物维持在某一恒定浊度,当培养室
11、中的浊度超过预期数值时,流速加快,使浊度降低; 当培养室中的浊度低于预期数值时,流速减慢,使浊度升高;,恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的,如果所用培养基中有过量的必需营养物,就可以使菌体维持最高的 生长速率。,二)恒化连续培养,使培养液流速保持不变,并使微生物始终在低于其最高 生长速率下进行生长繁殖。,通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物,多用于科研,遗传学:突变株分离; 生理学:不同条件下的代谢变化; 生态学:模拟自然营养条件建立实验模型;,第六章微生物的营养和产能代谢 第一节 微生物的营养物质,微生物的营养物质按其在机体中的生理作用可区分为: 碳源、氮
12、源、无机盐、生长因子和水五大类。,(一)、碳源,1、定义:任何作为构成微生物的细胞物质或其代谢产物中碳素来源的营养物质。 2、功能: (1) 构成微生物自身细胞物质和代谢产物; 能源物质; 所以,碳源不足会引起菌体衰老或死亡。 但有些又以CO2为唯一或主要碳源的微生物生长所需的能源则不是来自CO2。,3、碳源物质的种类及微生物的利用,(1) 有机碳化合物: 简单有机碳化合物: 复杂有机碳化合物: (2) 无机碳化合物: (3) 特殊和有毒碳化合物:,(二)、氮源,1、定义:凡是可以被微生物用来构成细胞物质的或代谢产物中氮素来源的营养物质。 2、功能:蛋白质及其各类降解产物 N源不足,菌体生长过
13、慢;过多,微生物生长过旺而不利于产物的积累。,3、氮源物质的种类及微生物的利用,(1) 有机氮化物: 简单有机氮化物:氨基酸、蛋白胨等; 复杂有机氮化物:蛋白质、核酸等。 (2) 无机氮化物:铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐 (少数微生物能利用)。 (3)分子态氮:少数固氮微生物能利用,如固氮菌。,(三)、无机盐(inorganic salt),1、定义:无机盐是微生物生长必不可少的一类营养物质, 生理功能主要是 作为酶活性中心 维持生物大分子和细胞结构的稳定性、 调节并维持细胞的渗透压平衡、 控制细胞的氧化还原电位 作为某些微生物生长的能源物质等。,2、对无机盐的需要情况,大量元素:P、K、Mg、Ca
14、、S、Na、(Fe), 生长需要的浓度:10-3-10-4mol/L; 微量元素:Fe、B、Cu、Zn、Mo、Co、Mn, 生长需要的浓度:10-6-10-8 mol/L (培养基中含量)。,(四)、生长因子(growth factor),1、定义:生长因子通常指某些微生物生长所必需而且需要量很小,但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。 不同微生物对生长因子的需要量和种类不同。,2、种类及功能:,生长因子分为 维生素是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢; 氨基酸:有些微生物自身缺乏合成某些氨基酸的能力, 嘌呤与嘧啶作用主要是作为酶的辅酶或辅基,,(五)、水,(1) 细胞的
15、组成成分 (2) 细胞生化反应的介质; (3) 起溶剂与运输介质的作用,营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成; (4) 维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象; (5) 调节体细胞的温度; (6) 保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素,即维持细胞内一定膨压;,第二节 微生物的营养类型,1、光能无机自养型:也称光能自养型,能以CO2为唯一碳源或主要碳源并利用光能进行生长的的微生物, 使CO2固定还原成细胞物质,并且伴随元素氧(硫)的释放。 藻类、蓝细菌和光合细菌属于这一类营养类型。,藻类和蓝细菌与高等植物光合作用是一致的,2、光能有机营养型,或称光能异养型,不能以C
16、O2作为唯一碳源或主要碳源,需以有机物作为供氢体,利用光能将CO2还原为细胞物质。 红螺属的一些细菌就是这一营养类型的代表 光能有机营养型细菌在生长时通常需要外源的生长因子。,3、化能无机自养型:,或称化能自养型,利用无机物氧化过程中放出的化学能作为它们生长所需的能量,以CO2或碳酸盐作为的唯一或主要碳源进行生长, 属于这类微生物的类群有硫化细菌、硝化细菌、氢细菌与铁细菌等.,4、化能有机营养型:,或称化能异养营养型,生长所需的能量来自有机物氧化过程放出的化学能,有机物通常既是它们生长的碳源物质又是能源物质。,微生物营养类型(),微生物的营养类型(),大多数微生物属于化能有机营养型:绝大多数的
17、细菌、全部真菌、原生动物以及病毒。 如果化能有机营养型微生物利用的有机物不具有生命活性,则是腐生型;若是生活在生活细胞内从寄生体内获得营养物质,则是寄生型。,第三节 培养基 一、什么是培养基,培养基(culture medium):是人工配制的,适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。 培养基中应含满足微生物生长发育的:水分、碳源、氮源、生长因子以及无机盐。,配制培养基的原则,一、选择适宜的营养物质 所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源,,培养细菌、放线菌、酵母菌、霉菌所需的培养基各不相同。 1.培养细菌:牛肉膏蛋白胨培养基(或简称普通肉汤培养基) ,
18、2.培养放线菌:用高氏I号合成培养基, 3.培养酵母菌:一般用麦芽汁培养基, 4.培养霉菌:一般用查氏合成培养基。,二、营养物质浓度及配比合适,营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需,浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用, 例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长,反而起到抑菌或杀菌作用。,培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累,其中碳氮比(C/N)的影响较大。,三、控制pH条件,各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同。 细菌与放线菌适于在pH77.5范围内生长,酵母菌和霉菌通常在pH4.56
19、范围内生长。 (如何控制生长过程中的PH值?),pH缓冲剂,维持培养基pH的相对恒定,通常在培养基中加入pH缓冲剂, 常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐(如KH2PO4和K2HPO4)组成的混合物。 K2HPO4溶液呈碱性,KH2PO4溶液呈酸性,两种物质的等量混合溶液的pH为6.8。,KH2PO4和K2HPO4缓冲剂的原理,当培养基中酸性物质积累导致H+浓度增加时,H+与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物,培养基pH不会过度降低;如果培养基中OH-浓度增加,OH-则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物,培养基pH也不会过度升高。 但KH2PO4和K2HPO4缓冲系统只能在一定的pH范围(pH6.47.2)内
20、起调节作用。,有些微生物,如乳酸菌能大量产酸,磷酸缓冲系统就难以起到缓冲作用,此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐(如CaCO3)来进行调节,CaCO3难溶于水,不会使培养基pH过度升高,但它可以不断中和微生物产生的酸,同时释放出CO2,将培养基pH控制在一定范围内。,四、原料来源的选择,尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分,在发酵工业中,培养基用量很大,利用低成本的原料更体现出其经济价值。,五、灭菌处理,要获得微生物纯培养,必须避免杂菌污染,对培养基一般采取高压蒸汽灭菌,一般培养基用1.05kg/cm2,121.3条件下维持1530min可达到灭菌目的。 灭菌:采用物理或化学的方法杀死一定
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