医学微生物学的新挑战2012 (2).ppt
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1、医学微生物学的新挑战,湖南省第二人民医院 尹铁球,OUTLINE,微生物学发展简史 感染性疾病与人类 自动化仪器的进展 分子生物学在微生物检验中的应用 细菌鉴定及分类 耐药性检测 病毒变异的临床意义,微生物学发展简史,经验微生物学时期 实验微生物学时期 现代微生物学时期,认识微生物的历程,微生物的发现 微生物学的开山鼻祖列文虎克 微生物学的奠基人巴斯德 医学微生物学的奠基人科赫,微生物学的经验时期 (十七世纪上半叶以前) 利用微生物,古希腊时蒸酒,微生物在地球上存在了30多亿年,人类并不知道一直和微生物生死共处 我国公元2000多年前就利用微生物酿酒 许多疾病是由微生物引起的:11世纪肺痨 我
2、国17世纪初,吴有性医生在瘟疫论中认为传染病是“乃天地间别有一种异气所感”,并且指出“气即是物,物即是气”,肯定地预见有某种实体是传染病的病原体 我国18世纪,描述鼠疫,实验微生物学时期 (十七世纪下半叶至二十世纪初) 1、微生物的发现和微生物形态学时期,荷兰人列文虎克(Leeuwenhoek)(1632-1723)是微生物学的先驱,微生物学的开山鼻祖 列文虎克,荷兰人用自己制造的显微镜观察到了被他称为“小动物”的微生物世界 发现了杆菌、球菌和螺形菌 实实在在看到并记录了一类从前没有人看到过的微小生命 因为这个伟大的发现,他当上了英国皇家学会的会员,列文虎克观察到的微生物,2、微生物生理学时期
3、 建立了一套独特的研究方法,寻找各种传染病病原菌,巴斯德在观察受狂犬病感染的兔脊髓,巴斯德在工作中,著名的巴斯德研究院,巴斯德在微生物学上的贡献,有机物发酵和腐败由微生物引起 解决葡萄酒和啤酒变酸问题创立巴氏消毒法 解决蚕茧的“微粒子病”的疾病,挽救了法国蚕丝业 主张传染病是由微生物引起的,并可通过接触、唾液及粪便传播 19世纪70年代,研究炭疽病,拯救了畜牧业 1881年研制成功减毒活疫苗开创人类战胜传染病的新世纪 1885年,巴斯德第一次治好了被疯狗咬伤的9岁男孩梅斯特奠定了免疫学基础,微生物方法学和医学微生物学奠基人 科赫,科赫,1882年发现引起结核病的病原分离出结核杆菌 创立了微生物
4、学检查方法:固体培养技术、染色技术、实验动物感染 发现炭疽杆菌、霍乱弧菌 总结了著名的“科赫法则” -确立病原微生物 1905年获得了诺贝尔医学和生理学奖,分离细菌的固体培养基,Koch氏确定病原体四要点,在每一例患病的病人中,都应找到此种微生物 该微生物能被分离,且能在纯培养基中生长 培养出的微生物接种于易感动物,一定能导致动物产生该病 在实验性发病动物中,一定能观察并重新获得此种微生物,李斯特在石炭酸喷雾下进行手术,李斯特 无菌操作奠基人,伊凡诺夫斯基 病毒的发现者 欧立希 (Ehrlich) 1910年砷凡纳明抗梅毒药的发现者,1929年青霉素发现者弗莱明 1940年弗洛瑞提纯应用于临床
5、,弗莱明 研究微生物的生命活动,Domagk发现黄胺药,Griffith发现细菌转化现象,新病原微生物的确定方面 1974年从莱姆(Lyme)病患者分得疏螺旋体 1976年在美国费城一次退伍军人会议期间发生 肺炎流行,次年分离出军团菌 1983年从慢性胃炎病人活检标本中分离出 幽门螺杆菌,现代微生物学时期,二十世纪中叶至今,1986年我国台湾省分离得肺炎衣原体 1983年首先在美国发现人类免疫缺陷病毒 (HIV) 近期新发现的病毒有肾综合征出血热病毒、新疆出血热病毒、B 组轮状病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒等,1973年以来认识的病原体示例,年份 微生物 疾病 1973 轮状病毒 全球性婴儿
6、腹泻的主要原因 1976 小隐孢子虫 急性和慢性腹泻 1977 埃博拉病毒 埃博拉出血热 1977 嗜肺性军团杆菌 军团病 1977 Hantaan病毒 伴有肾综合征的出血热 1977 空肠弯曲菌 全球散布的肠病 1980 HTLV-I T细胞淋巴瘤白血病 1981 金葡萄菌产毒素株 中毒性休克综合征 1982 大肠杆菌O157:H7 出血性肠炎、溶血性尿毒症 1982 HTLV-II 毛细胞白血病 1982 Burgdorferi螺旋体 莱姆病 1983 HIV 爱滋病 1983 幽门螺旋杆菌 消化性溃疡病 1988 HEV 肠道传播的非A、非B型肝炎 1990 Guanarito病毒 委内
7、瑞拉出血热 1992 霍乱弧菌O139 与流行性霍乱有关的新株 1992 Hellem巴尔通氏体 猫抓病,杆状血管瘤病 1994 Sabia病毒 巴西出血热 1995 G型肝炎病毒(HGV) 非肠道传播的非A、非B型肝炎 1995 人类疱疹病毒8型 与爱滋病有关的Kaposi肉瘤 1996 TSE致病因子 克罗伊茨非尔特-雅各布病的新变型 1997 禽流感病毒A(H5N1) 流感,汤飞凡发现沙眼衣原体,病原微生物的致病机制方面 微生物基因组研究方面 微生物检测技术方面 防治病原微生物措施方面,感染性疾病与人类,人类已经宣布消灭的疾病:天花 在某些地区已经得到控制的疾病:麻疹、脊髓灰质炎、白喉、
8、百日咳、结核、鼠疫 正在流行的疾病:伤寒、痢疾、病毒性肝炎、霍乱,感染性疾病与人类,新发生的传染性疾病 原有微生物的再发,一、新发生的传染性疾病,1、原已存在但未被认为是传染病 例如,消化性溃疡 ,T细胞白血病,2、可能早已存在但未知,技术进步发现或人畜接触机会增加 例如,丙型肝炎,莱姆病,3、过去确实不存在,由于微生物发生变异而产生 例如, AIDS, O139 ,耐药菌株,禽流感,SARS,新发生的传染性疾病的原因,人类的不良行为 进入以前未进入的原始森林和地区 采矿 旅游 开垦 嗜食野生动物 宠物热 性乱和吸毒 气候 都市化 人口迁移 拥挤 易感人群增加 “贫民区” 医源性感染和滥用抗生
9、素 战争 贸易 水土流失 微生物的持续不断变异,新近认识的致病微生物,禽流感病毒、SARS、H1N1、产NDM-1细菌,产NDM-1细菌,超级细菌?,产NDM-1细菌,产NDM-1细菌:全称“产型新德里金属-内酰胺酶(New Delhi Metallo-lactamase 1, NDM-1)肠杆菌科细菌”,简称“产NDM-1细菌”,是一种对多种抗菌药物广泛耐药的细菌,主要为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌; 特点: 属于肠杆菌科细菌,致病力与普通肠杆菌科细菌没有差别; 由于产生NDM-1导致广泛耐药,为“泛耐药菌”; 主要导致医院感染; 源于南亚地区,已在全球播散。,细菌耐药概念,多重耐药(multi
10、ple drug resistance, MRD): 指细菌同时对三种以上结构不同(作用机制不同)抗菌药物耐药,如头孢菌素、喹诺酮类、氨基糖苷类; 泛耐药(pan-drug resistance, PDR):细菌对本身敏感的所有药物耐药; 超级细菌(superbug):并非科学概念,一般指PDR与部分MDR,没有确切定义,以下细菌属于此列: MRSA/VRSA; VRE; MDR-PA,PDR-AB; ESBL(+)+AmpC(+) 肠杆菌 产碳青霉烯酶肠杆菌(包括产NDM-1细菌),细菌耐药的危害,Cosgrove, et al.Clinical Infectious Diseases 20
11、06; 42:S829,产与不产ESBL大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染的后果比较,细菌耐药的危害,肖永红 等,抗生素类药物滥用公共问题研究,2008,为什么需要关注产NDM-1细菌,泛耐药导致的治疗挑战; 多种肠杆菌科细菌发现; 快速从南亚地区传播到欧美国家; 不仅在医院感染这种发现,同时社区感染这种发现。,产NDM-1细菌的发现,2008年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌,该菌对所有-内酰胺类抗菌药物耐药,对环丙沙星也不敏感,仅对多粘菌素E敏感; 该患者有多年糖尿病和中风史,经常往返于印度和瑞典之间,此前4月曾因臀部脓肿在印度住院治疗,其后回到瑞典,因尿路感染再度入
12、院; 这株细菌携带一种新型金属-内酰胺酶,研究人员根据患者感染地命名这种酶为NDM-1。,南亚和英国流行情况, Published online August 11, 2010 DOI:10.1016/S1473-3099(10)70143-2,产NDM-1细菌种类,传播方式,医院内感染 污染的医疗器械; 污染的医疗用品; 污染的手 跨国传播 跨国医疗旅游,产NDM-1细菌感染临床特点,产NDM-1细菌主要表现为多重耐药,致病力与敏感细菌没有差别; 主要引起医院感染;有社区感染报道; 感染危险因素: 危重患者,入住ICU; 长期住院患者; 使用广谱抗菌药物,或长期应用抗菌药物; 插管或侵袭性操
13、作; 免疫抑制; 呼吸机应用; ,产NDM-1细菌感染临床特点,主要感染类型: 泌尿道感染; 伤口感染; 医院肺炎;呼吸机相关肺炎; 血流感染; 导管相关感染; 感染表现没有特别之处。 碳青霉烯治疗感染无效,提示该类细菌感染可能,需要及时进行检查。,实验室诊断,产NDM-1细菌感染临床表现与敏感菌没有差异,临床诊断困难; 对碳青霉烯治疗无效的阴性菌感染需要考虑这类细菌感染可能; 诊断主要依据实验室检查结果; 实验室检查分为三步: 表型筛查-表型确认-基因确证,产NDM-1细菌表型筛查,美罗培南或亚胺培南纸片法(K-B法,10g纸片)或最低抑菌浓度(MIC)测定法对肠杆菌科细菌进行初步筛查,达到
14、以下标准,需进行表型确认。 K-B法:美罗培南或亚胺培南抑菌圈直径22mm。 MIC测定法:美罗培南MIC2mg/L;或亚胺培南对大肠埃希菌、克雷伯菌属、沙门菌属和肠杆菌属MIC2mg/L。,亚胺培南,美罗培南,亚胺培南,美罗培南,产NDM-1细菌表型确认,双纸片协同试验:采用亚胺培南(10g)、EDTA(1500 g) 两种纸片进行K-B法,两纸片距离10-15mm,在含EDTA纸片方向处,亚胺培南抑菌圈扩大,即可判定产金属酶。,产NDM-1细菌表型确认,采用亚胺培南(美罗培南)/EDTA复合纸片进行K-B法药敏试验,复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值5mm;亚胺培南(美罗培南)/EDTA
15、 复合E试条协同试验测定MIC,单药与复合制剂的MIC比值8;即可判定产金属酶。,产NDM-1细菌基因确证,采用NDM-1的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序。,PCR,测序,各医院对阳性结果须加以复核,同时菌株送有条件参考实验室进一步检测确证。,1.加强对产NDM-1细菌监测,医院重视临床微生物检验,提高细菌耐药监测能力; 临床参考细菌检验结果应用抗菌药物; 定期公布各医院细菌耐药监测结果; 定期回顾细菌耐药流行趋势,及时发现异常耐药现象,早期发现产NDM-1细菌加以控制。,2.加强抗菌药物合理使用监管,医疗机构应当有专门抗菌药物合理使用管理小组,开展教育、培训、监督、检查抗菌药物使用情况
16、; 严格执行相关管理规定,特别是抗菌药物分类管理规定。 特殊使用抗菌药物卫生部卫办医政发(2009)38号 第四代头孢菌素:头孢吡肟、头孢匹罗、头孢噻利等; 碳青霉烯类抗菌药物:亚胺培南/西司他丁、美罗培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南等; 多肽类与其他抗菌药物:万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺等; 抗真菌药物:卡泊芬净,米卡芬净,伊曲康唑(口服液、注射剂),伏立康唑(口服剂、注射剂),两性霉素B含脂制剂等。,3.加强医院感染的预防与控制,加强医务人员感染控制教育、培训,强化对NDM-1细菌等多重耐药菌感染的预防、控制的认识。 在进行各种侵袭性操作中,严格执行无菌操作。,严格执行医务
17、人员手卫生规范: 医疗机构必须提供充足的手卫生设施。 医务人员在接触病人前后、进行侵入性操作前、接触病人使用的物品或处理其分泌物、排泄物后,必须洗手或用含醇类速干手消毒剂擦手。,3.加强医院感染的预防与控制,3.加强医院感染的预防与控制,加强对重点部门尤其是ICU物体表面的清洁、消毒 。 消毒剂:含氯消毒剂、0.5%过氧乙酸、2%戊二醛、0.5%醋酸环己啶-乙醇等; 表面消毒方法:选择不同消毒液擦拭或浸泡。,3.加强医院感染的预防与控制,隔离疑似或确诊产NDM-1细菌感染或定植者,预防耐药菌传播。采用接触隔离,将病人安置单独房间,接触患者时需要穿隔离衣、戴手套,相关医疗器械或物品如听诊器、血压
18、计等专用,不能专用的物品,需用后严格消毒。 隔离期间需要定期检测耐药菌情况。,二、原有微生物的再发,病毒性疾病 狂犬病、登革热、黄热病 寄生虫 疟疾、血吸虫病、神经囊尾幼病、棘阿米巴病、内脏利氏曼病、弓形虫病、贾第虫病 、棘球幼病 细菌性 A群链球菌、战壕热、鼠疫、白喉 、结核、百日咳、沙门菌属、肺炎球菌、霍乱、多重耐药菌株的流行,多重耐药菌株的流行,葡萄球菌 肠球菌 肺炎链球菌 肠杆菌科 结核分支杆菌,多重耐药的结核杆菌,是指病人排出的TB至少已对INH和RFP产生耐药或对5种基本抗痨药物(INH、RFP、链霉素、乙胺丁醇、砒嗪酰胺)中的两种以上(包括两种)耐药者 发生原因:单一化疗、不合理
19、化疗、不规律化疗 对策: 合理化疗,预防MTB出现 加强检测,及时检出MTB 约有75%的临床分离株存在RNA聚合酶亚单位基因(rpo B)发生突变,对RFP耐药,肠杆菌科,对三代头孢菌素耐药的肠杆菌科在临床大量出现 主要耐药机制: 产生超广谱-内酰胺酶(Extend-spectrum -Lactamases,ESBLs) 持续产型-内酰胺酶,肠球菌,可引起多种临床感染 对头孢菌素、林可霉素、磺胺类呈现天然耐药,对氨基糖甙类部分天然耐药 现已出现耐万古霉素的肠球菌(VRE),耐万古霉素的肠球菌(VRE),由VanA,VanB和VanC控制 VanA对万古霉素和替考拉宁高度耐药 VanB对万古霉
20、素高度耐药,对替考拉宁敏感 VanC对万古霉素和替考拉宁高度耐药 选用氯霉素红霉素四环素及利福平或其它药物,葡萄球菌,对甲氧西林耐药的葡萄球菌 对万古霉素中度敏感的葡萄球菌 对万古霉素耐药的葡萄球菌,对甲氧西林耐药的葡萄球菌,由mecA基因编码的PBP2a与现有的-内酰胺类抗生素亲和力极低 常伴有大内环酯类、林可霉素类和其它抗生素的多重耐药 常呈异质性表达 万古霉素是唯一有确切疗效的药物 凝固酶阳性和阴性的葡萄球菌均有较高的发生率,MRSA的调控机制,调控基因 mec I, mec RI Mec I 为阻遏基因,其编码产物为mec I蛋白,为mec A基因的抑制子(repressor) Mec
21、 RI 为诱导剂激活基因,在诱导剂存在时编码mec RI蛋白,是一种辅助诱导因子(co-inducer),解除对mec I蛋白对mec A基因的抑制,对万古霉素中度敏感的 葡萄球菌(VISA or GISA),对万古霉素的MIC在8-16ug/ml 已有数起报道、主要发生在MRS中 测定困难:异源性表达、生长缓慢、常规方法不能识别(K-B法、MicroScan rapid plate) Vitek 旧版软件不能测定(只能测到4ug/ml万古霉素),新版能测定,三、自动化技术在微生物学 检验中的应用,数码及数值鉴定技术 常见的鉴定系统,常见的鉴定系统,VITEK AMS系统 icroScan系统
22、 BD BD Phoenix System BBLCrystal半自动细菌鉴定系统 BBLCrystal AutoReader自动细菌鉴定系统,使用自动化鉴定仪的局限性,所有实验室工作人员必须认识仪器的局限性。 细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变,及时补充和修改数据库是自动化鉴定仪生存的根本 要加强对自动化仪器的日常维护和质控 自动化鉴定仪得出的结果,必须要与其它已获得的生物性状(如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征)进行核对,以避免错误的鉴定。,四、分子生物学在微生物检验应用,核酸杂交(生物芯片) 核酸扩增技术 靶扩增系统,包括PCR、TMA、SDA; 探针扩增系统,包
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