第一讲核酸化学实验技术导学.ppt
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1、生化实验技术,主讲:钱国英 教授 浙江万里学院,第一讲 核酸化学实验技术 第二讲 蛋白质化学实验技术 第三讲 酶学实验技术 第四讲 糖类化学实验技术 第五讲 脂类化学实验技术 第六讲 维生素和辅酶化学实验技术,实验授课内容,课堂理论:课前辅导生化大分子基本性质、提取、分 离纯化、含量检测等相关生化物质的分离分析技术。 项目任务:设计案例,引导学生去解决案例问题的方式 向学生布置项目任务、实验设计和实施要求。 实验设计:学生分组查阅资料设计实验方案 网上递交教师修改及审核大组讨论评价 实验操作:各小组(2人)为单位进行实验试剂、器材的 准备,按实验设计完成实验内容操作。 实验论文:根据任务要求,
2、每位学生独立完成课程论文。 课堂讨论:大组为单位进行全班ppt形式交流汇报,实验实施流程,第一讲 核酸化学实验技术,案例1,目前,人们的生活中充斥了越来越多的转基因产品,如转基因大豆、转基因棉花、转基因玉米、马铃薯、水稻等等。 转基因作为一种新兴的生物技术手段,它的不成熟和不确定性,使得转基因食品的安全性成为人们关注的焦点。,问题:如何检测转基因食品?,第一节 实验项目发布与设计方案评价,什么是转基因食品?,转基因食品:以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品。 转基因食品利用现代分子生物技术,将某些生物的基因转移到其他物种中去,改造生物的遗传物质,使其在形状、营养品质、消费品质等方面向人
3、们所需要的目标转变。,转基因育种的程序?,标记基因 启动子 外源目的基因 终止序列,载体的构建,转基因食品的核酸检测技术,检测对象:转基因的启动子、终止子、抗性筛选基因、目的基因等外源基因 检测方法:普通定性PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片 其中以普通定性PCR、实时荧光定量PCR最常用。,核酸定性PCR法检测转基因食品,样品基因组DNA的提取 DNA提取质量检测 特有序列的PCR 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 进一步验证:测序、PCR产物酶切鉴定、实时荧光定量PCR方法等,一般步骤,核酸定性PCR法检测转基因食品,案例2,某实验人员从土壤中分离筛选出一株产植酸酶的菌株,经形态学和生理生化
4、特性初步鉴定为真菌。 真菌种类繁多,地球上大约存在150万种真菌,已经被发现和运用的大约有69000种。,生物遗传物质携带了物种的特异信息,在属种间具有高度的保守性。因此,可应用分子生物学鉴定手段对真菌进行种类鉴定和系统分类。,问题:如何准确鉴定其种属 ?,图1 真菌rDNA转录区和相关引物,真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S、5S、18S和5.8S rDNA 4种,在染色体上头尾相连,串联排列,相互间由间隔区分隔。 18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元(图1),三者高度保守,适合较高等级水平生物群体间的系统分析。 其间的间隔区为内转录间隔区(Internal Tra
5、nscribed Spacer,ITS),包括ITS1和ITS2,进化相对迅速,具有多态性,适合较低等级水平的系统学研究。,设计特定引物对该真菌菌株中的基因组中的rDNA转录区的特定核苷酸片段进行PCR扩增,通过对所获得的PCR产物进行测序分析,与已知真菌序列比对即可确定该菌株在系统分类学上的位置。,基于rDNA-ITS序列在真菌分子鉴定中的应用,你如何获得高质量的基因组DNA并鉴定菌株的目的基因序列?,表1 真菌rDNA-ITS通用扩增引物,图1 真菌rDNA转录区和相关引物,真菌rDNA-ITS通用引物,实验设计要求: 根据案例提交一个具体解决基因组提取及分离鉴定的实验设计方案,包括从提供
6、的不同材料中提取、分离得到基因组DNA,测定所得DNA的含量、纯度及分子大小,并利用已知引物进行PCR扩增,分析PCR检测的结果。,实验题目: 基因组DNA的提取与PCR鉴定,实验项目与任务布置,分组题目,项目1:定性PCR法检测转基因食品 项目2:rDNA-ITS扩增法鉴定真菌种类,全班分成4大组,各选一个题目。 每个大组3个小组,2名同学一个小组。 以大组为单位进行实验准备和讨论。 以小组为单位进行实验设计和操作。,实验目标,学习从各种材料(动物、植物组织、微生物)中提取和纯化DNA的原理和操作技术。 学习水平式琼脂糖凝胶电泳及紫外检测,确定DNA的纯度、含量与分子大小。 学习PCR的基本
7、原理和操作方法。 掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪、PCR仪等仪器设备的使用。,实验设计需包含的主要技术内容,基因组DNA提取:可选用浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法、水抽提法、试剂盒法等 DNA含量测定:可选用二苯胺法、紫外分光光度法等 DNA纯度测定:紫外分光光度法 DNA分子大小测定:琼脂糖凝胶电泳 PCR技术,实验结果要求,各标准曲线 基因组DNA产品得率(mg/100g) 基因组DNA产品纯度 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 PCR产物分子大小(bp) 检测结论,基因组DNA提取 4学时 DNA的含量与纯度测定 4学时 DNA的琼脂糖凝胶电泳 4
8、学时 PCR及产物检测 4学时,实验时间安排,课后研讨题,1.DNA提取的方法主要有哪些?并说明各方法的原理。 2.结合本人实验操作的体会,试述在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂? 3.查阅资料,说明提取的基因组DNA有哪些方面的用途? 4.查阅资料,举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应用和发展。 5.琼脂糖凝胶电泳所用DNA染料EB具有潜在的致癌性,查阅资料,查找可替代EB的染料并说明优缺点。,课后研讨题,6.结合本次实验,说明PCR技术的主要用途和发展。 7.通过本次实验,谈谈你对转基因食品安全性的认识。 8.查阅资料,说明转基因食品检测的常规方法。 9.查阅资料,综述常用的物种分
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