第七八九章酶.ppt
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1、第七章 酶通论,酶的概念,酶的分类与命名,酶的化学本质,酶作用的专一性,酶的制备与酶活力的测定,提要,一、酶的概念,酶是生物细胞产生的、具有催化能力的蛋白质。,定义:酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。,酶具有一般催化剂的特征: 1.只能进行热力学上允许进行的反应; 2.可以缩短化学反应到达平衡的时间,而不改变反应的平衡点; 3.通过降低活化能加快化学反应速度。,2.专一性:酶对底物和催化的反应都具有严格的选择性。,3.酶易失活性:对环境条件极为敏感。,4.可调性:酶活性的调节和酶合成速度的调节。 浓度;活性,酶作为生物催化剂的特点:,1.高效性:通
2、常要高出非生物催化剂催化活性的1061013倍。,1mol过氧化氢酶 5106molH2O2 1mol离子铁 610-4molH2O2,二、酶的化学本质,(一)大多数酶是蛋白质,(1)酶是蛋白质: 1926年,James Summer由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质的观念,其具有蛋白质的一切性质。 (2)核酶的发现: 19811982年,Thomas R.Cech实验发现有催化活性的天然RNARibozyme。 L19 RNA和核糖核酸酶P的RNA组分具有酶活性是两个最著名的例子。 1955年,发现DNA的催化活性。 (3)抗体酶(abzyme): 1986年,Richard Lerrur和P
3、eter Schaltz运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体(catalytic antibody)。,ribozyme核酶(具有催化功能的RNA) 1980以前,已知所有的生物催化剂,其化学本质都是蛋白质。 80年代初,美国科罗拉多大学博尔德分校的Thomas Cech和美国耶鲁大学Sidney Altman各自独立发现RNA具有生物催化功能,此发现被认为是近十年生化领域最令人鼓舞的发现,此二人分亨1989诺贝尔化学奖。 ribozyme种类: 自我剪接ribozyme 自我剪切ribozyme 催化分子间反应ribozyme,抗体酶 abzyme(antibody enzyme) 又称
4、催化性抗体(catalytic antibody) 是一种具有催化功能的抗体分子。 过渡态理论:酶与底物在过渡态结构互补,亲和力最强,释放出的结合能使过渡态结合物能级降低,利于反应物分子越过能垒,加速反应。 抗体与抗原是基态结合。,(二)酶的辅因子,酶,单纯酶,结合酶,(全酶)= 酶蛋白 + 辅因子,辅因子,辅酶,:与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。,辅基,:与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。,金属激活剂,:金属离子作为辅助因子。,酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分,辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。,酶的辅因子 酶的辅因子是酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分,其主要作用是作为
5、电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程。 (1)传递电子体:如 卟啉铁、铁硫簇; (2)传递氢(递氢体):如 FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸; (3)传递酰基体:如 C0A、TPP、硫辛酸; (4)传递一碳基团:如 四氢叶酸; (5)传递磷酸基:如 ATP,GTP; (6)其它作用: 转氨基,如 VB6 ;传递CO2,如 生物素。,(三)单体酶、寡聚酶和多酶复合物,1.单体酶(monomeric enzyme):仅有一条具有活性部位的多肽链,全部参与水解反应。 牛胰RNase 124aa 单链 鸡卵清溶菌酶 129aa 单链 胰凝乳蛋白酶 三条肽链 单体酶种类较
6、少,一般多催化水解反应。,2.寡聚酶 (oligomeric enzyme):由几个或多个亚基组成,亚基牢固地联在一起,单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。 A.含相同亚基的寡聚酶 苹果酸脱氢酶(鼠肝),2个相同的亚基。 B.含不同亚基的寡聚酶 琥珀酸脱氢酶(牛心),2个亚基。 寡聚酶中亚基的聚合,有的与酶的专一性有关,有的与酶活性中心形成有关,有的与酶的调节性能有关。 大多数寡聚酶是胞内酶,而胞外酶一般是单体酶。,丙酮酸脱氢酶系(E.coli):丙酮酸脱氢酶(E)、硫辛酰转乙酰酶(E)和二氢硫辛酰脱氢酶(E)。,碱性,3.多酶复合物 (multienzyme system):几个酶
7、镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成: 丙酮酸脱氢酶(E1) 以二聚体存在296000 二氢硫辛酸转乙酰基酶(E2) 70000 二氢硫辛酸脱氢酶(E3) 以二聚体存在256000 12个E1 二聚体 2496000 24个E2 单体 2470000 6个E3 二聚体 1256000 总分子量:560万,4.多酶融合体 一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶,往往是基因融合的产物。 例如:天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I融合体(双头酶) 该酶是四聚体4,每条肽链含两个活性区域:N-端区域是Asp激酶,C端区域是高Ser脱氢酶。
8、,三、酶的分类与命名,1961年国际酶学委员会(Enzyme Committee, EC)根据酶所催化的反应类型和机理,把酶分成6大类:,1. 氧化还原酶类:主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。,AH2 + B(O2),A + BH2(H2O2,H2O),(1)脱氢酶类:催化直接从底物上脱氢的反应。,AH2 +B,A +BH2(需辅酶或辅酶),(2)氧化酶类,催化底物脱氢,氧化生成H2O2:,AH2 + O2,A + H2O2(需FAD或FMN),催化底物脱氢,氧化生成H2O:,2AH2 + O2,2A + 2H2O,(3)过氧化物酶,ROO + H2O2,RO + H2O + O2,
9、(4)加氧酶(双加氧酶和单加氧酶),(顺,顺-已二烯二酸),RH + O2 + 还原型辅助因子,ROH + H2O + 氧化型辅助因子,(又称羟化酶),2. 转移酶类:催化化合物中某些基团的转移。,AX + B,A +BX,根据X分成8个亚类:转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。,3. 水解酶类:催化加水分解作用。,AB + H2O,AOH + BH,4. 裂解酶类:催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。,CC键,+ CO2,CO键,+ H2O,CN键,+ NH3,5. 异构酶:催化 各种异构体之间的互变。,常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位
10、酶类。,6. 合成酶类:催化有ATP参加的合成反应。,酶的命名有两种方法:系统名、惯用名。,系统名:包括所有底物的名称和反应类型。,乳酸 + NAD+,丙酮酸 + NADH + H+,乳酸:NAD+氧化还原酶,系统名称包括底物名称、构型、反应性质,最后加一个酶字。,习惯命名法: 根据其催化底物来命名,蛋白酶、淀粉酶; 根据所催化反应的性质来命名,水解酶、转氨酶; 结合上述两个原则来命名,琥珀酸脱氢酶; 有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点,胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶。,乳酸:NAD+氧化还原酶,乳酸脱氢酶,对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。,国际分类的盲区:忽略了酶的物种差
11、异和组织差异。 SOD: EC1.15.1.1,只有一个名称和编号 2O2-+2H+H2O2+O2 三类不同的SOD: CuZn-SOD 真核生物细胞质中 Mn-SOD 真核生物线粒体中 Fe-SOD 同是CuZn-SOD,来自牛红细胞与猪红细胞的,其一级结构也有很大不同。 在讨论一个具体的酶时,应对它的来源与名称一并加以说明。,四、酶作用的专一性,酶作用的专一性,结构专一性,立体异构专一性,族(基团)专一性,绝对专一性,族专一性:可作用于一类或一些结构很相似的底物。,绝对专一性:只能作用于某一底物。,2NH3 + CO2,五、酶的分离提纯及活力测定,(一)酶的分离提纯,(二)酶的量度,二、酶
12、的量度 用酶的活力单位表示 1.酶活力与酶促反应速度 酶活力:在一定条件下,酶催化某一反应的反应速度。 酶促反应速度:单位时间、单位体积中底物的减少 量或产物的增加量。 单位:浓度/单位时间,研究酶促反应速度,以酶促反应的初速度为准。,2. 酶的活力单位(U) 标准单位:在特定条件下,1分钟内转化1mol底物的酶量,称一个国际单位(IU)。 特定条件:25 ,pH及底物浓度采用最适条件。 实际工作中,每一种酶的测活方法不同,对酶单位分别有一个明确的定义。,酶活力单位 酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示,单位为mol/min等。 酶活力单位的基本定义为:规定条件(最适条
13、件)下一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。 据不同情况有几种酶活力单位(activity unit)或又称酶单位(enzyme unit)。 国际单位: 一般用活力单位U(Unit)表示,许多酶活力单位都是以最佳条件或某一固定条件下每分钟催化生成1mol产物所需要的酶量为一个酶活力单位,一个“Katal”单位是指在一定条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。 Kat和U的换算关系:1 Kat=6107U,1U=16067n Kat 以上的酶单位定义中,如果底物(S)有一个以上可被作用的化学键,则一个酶单位表示1分钟使1mol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应,则每分钟催
14、化2mol底物转化的酶量称为一个酶单位。 在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中,酶催化底物的分子量必须是已知的,否则将无法计算。 习惯单位: 在实际使用中,结果测定和应用都比较方便、直观,规定的酶活力单位,不同酶有各自的规定,如: -淀粉酶活力单位:每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。(QB546-80),也有规定每小时分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。显然后者比前一个单位小。 糖化酶活力单位:在规定条件下,每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个酶单位。 蛋白酶:规定条件下,每分钟分解底物酪蛋白产生1g酪氨酸所需的酶量。 DN
15、A限制性内切酶:推荐反应条件下,一小时内可完全消化1g纯化的DNA所需的酶量。,限制性核酸内切酶的3种定义: 用粘度法测活性:30,1分钟,使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。 转化率法:5分钟使1g供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个酶单位。 凝胶电泳法测活:37,1小时,使1gDNA完全水解的酶量为1个酶单位。,淀粉酶两种定义: A:1g可溶性starch,在1h内液化所需的enzyme 量。 B:lml 2%可溶性starch ,在1h内液化所需的enzyme量。,3. 酶的比活力 Specific activity 每毫克酶蛋白所具有的酶活力。 单位:U/m
16、g蛋白质。 酶的比活力是分析酶的纯度的重要指标。,一个酶的分离纯化分为4 步: 步骤 1 2 3 4 总活力(U) 6 4 3 2 总蛋白质(mg) 20 10 5 2 比活力(U/mg) 6/20 4/10 3/5 2/2 酶的提纯过程中,总蛋白减少,总活力减少,比活力增高。 酶的纯化倍数: 酶的回收率: 100%,一个酶的分离纯化分为4 步: 步骤 1 2 3 4 总活力(U) 6 4 3 2 总蛋白质(mg) 20 10 5 2 比活力(U/mg) 6/20 4/10 3/5 2/2 酶的提纯过程中,总蛋白减少,总活力减少,比活力增高。 酶的纯化倍数: 酶的回收率: 100%,4. 酶的
17、转换数和催化周期 每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数称为转换数Kcat,。 P244 表44某些酶的最大转换数 每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。 转换数的倒数即为催化周期:一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。 乳糖脱氢酶转换数为1000/秒,则它的催化周期为10-3秒。,例题:,某无细胞的粗提液,每ml含20 mg 蛋白质。在0.5ml的标准总反应体积中,含有10 l 这中提取液。在最适宜条件下,一分钟内生成30ng的产物。求: 用下述单位表示反应速度v : nmol/ml /min, nmol/L/min, mol/L/min, mol/L/min 若10 l该提取液,在1 ml总反应
18、体积中进行实验,其反应速度是多少? 反应混合液和提取液中酶活性浓度各是多少? 酶制剂的比活力是多少?,解:,V=30/0.5=60 nmol/ml/min =60 10 3 nmol/L/min =60 mol/L/min =6 10-5 mol/L/min V=30/1 =30 nmol/ml/min =3 10-5 mol/L/min 反应液酶活性浓度= 60 nmol/ml/min =0.06mol/ml/min =0.06单位/ml 0.5 ml的反应液内含0.03单位酶,即10 l (0.01 ml) 提取液含0.03单位酶,所以: 提取液酶活性浓度=0.03/0.01=3单位/ml
19、 酶比活=3/20=0.05单位/mg蛋白,酶的制备与活力的测定,酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。,酶(活力)单位:在一定条件下,一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。(U/g,U/ml),在最适的反应条件(25)下,每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位,即 1IU=1mol/min,在最适条件下,每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位,即 1kat=1mol/s,1kat = 6107IU,工业上大多采用微生物发酵的方法来获得大量酶制剂。,优点:不受气候、地理条件的限制,动、植物体内的酶大多可从微生物体内找到,微生物繁殖快,产酶量由丰富。还
20、可以通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产。,酶分离纯化的三个基本步骤:抽提,纯化,结晶或制剂。,方法:1.根据溶解度不同(盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法); 2.根据酶与杂蛋白分子大小的差别(凝胶过滤法、超离心法);3.根据酶和杂蛋白与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同(吸附分离法);4.根据带电性质(离子交换层析法、电泳分离法、等电聚焦层析法);5.根据酶与杂蛋白的稳定性差别(选择性变性法);6.根据酶与底物、辅因子或抑制剂之间的专一性亲和作用(亲和层析法)。,酶的纯度: 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白(氮),酶的纯化鉴定:聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法
21、,酶的保存:1.低温(04,-20);2.高浓度较稳定;3.加入稳定剂;4.固定化。,酶的固定化就是把水溶性酶经物理(吸附法与包埋法)或化学方法(共价偶联法与交联法)处理后,使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。,吸附法:使酶被吸附于惰性固体的表面,或吸附于离子交换剂上。,包埋法:使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。,偶联法:使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。,交联法:使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状”结构。,第八章 酶促反应动力学,酶促反应的速度和影响酶促 反应速度的因素,一、酶反应速度的测量,用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速
22、度。测定反应的初速度。,二、酶浓度对酶作用的影响,在有足够底物和其他条件不变的情况下: v = k E,三、底物浓度对酶作用的影响,1. 底物浓度对酶反应速度的影响,一级反应 v = k S,零级反应 v = k E,在酶浓度,pH,温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示: 在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比,表现为一级反应特征。 当底物浓度达到一定值,几乎所有的酶都与底物结合后,反应速度达到最大值(Vmax),此时再增加底物浓度,反应速度不再增加,表现为零级反应。,用中间产物学说解释底物浓度与反应速度关系曲线的二相现象:,当底物浓度很低时,有多余的酶没与底物结
23、合,随着底物浓度的增加,中间络合物的浓度不断增高。,当底物浓度较高时,溶液中的酶全部与底物结合成中间产物,虽增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成。,2. 米氏方程式(Michaelis-Menten equation),k1,k2,k3,(kmS,v = kS; km S,v = Vmax),米氏方程的推导:,3. 米氏常数的意义及测定,v = Vmax/2, 则: km= S,意义:,(1) km是酶的一个基本的特征常数。其大小与酶的浓度无关,而与具体的底物有关,且随着温度、pH和离子强度而改变。,(2)从km可判断酶的专一性和天然底物。 Km最小的底物,通常就是该酶的最适底物,也就是天然
24、底物。,(3)当k2k3时, km的大小可以表示酶与底物的亲和性。, km= (k2 +k3)/k1,Km k2 / k1, km可以看作ES的解离常数ks :,当km大,说明ES容易解离,酶与底物结合的亲和力小。,(4)从km的大小,可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度。,从米氏方程中求得: 当反应速度达到最大反应速度的90%,则,90%V =100%VS/(km +S),即 S = 9km,在进行酶活力测定时,通常用4km的底物浓度即可。,(5)km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。,丙酮酸,乳酸,乙酰CoA,乙醛,乳酸脱氢酶(1.710-5),丙酮酸脱氢酶(1.310-3),丙
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