第三章动物细胞制药part1.ppt
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1、第三章 动物细胞制药,动物细胞的结构较原核细胞复杂得多,而且以不 是靠一个细胞包办一切生理活动,各细胞都有明确的 分工。为了适应其功能需要,细胞的形态也有了相应 的变化,我们称这种变化为分化。如:红细胞呈圆盘 形;神经细胞呈纤维形。然而当细胞离体培养时这些 分化的形态经常会发生变化。我们通常将离体培养的 细胞分为:贴壁依赖型(贴壁细胞)和贴壁非依赖型 (悬浮细胞)。,一、动物细胞的形态和生理特点,贴壁细胞 这类细胞的生长必须有给你贴附的支持物表 面,细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附 因子才能在该表面上生长、增殖。当细胞在该表 面生长后,一般形成两种形态,即成纤维样细胞 型或上皮细胞型。这
2、些细胞形态不是绝对的,它 随培养条件的变化而有所变化。,一、动物细胞的形态和生理特点,悬浮细胞 这类细胞的生长不依赖支持物表面,可在培 养液中呈悬浮状态生长。,一、动物细胞的形态和生理特点,兼性贴壁细胞 这类细胞并不严格地依赖支持物表面生长, 一定条件下,它们还可以在培养基中呈悬浮状 态良好地生长。这类细胞称之为兼性贴壁细胞。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点 细胞的分裂周期长 动物细胞分裂周期所需的时间一般为1248 h,它不仅随细胞种属的不同而不同,同一种 属,不同部位的细胞所需的时间也不同。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点 细胞生长需贴附于基质,并有接触
3、抑制现象 当细胞在基质上分裂增殖,逐渐会合成片时 ,即每个细胞与其周期的细胞相互接触时。细胞 就停止繁殖。此时若能保持充足的营养,细胞仍 可存活相当一段时间。但细胞密度密度不再增加 ,所以该现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现 象。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点 3. 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 当细胞离体培养开始,我们称之为原代培养。 以后经传代后,即成为有限细胞系。细胞经若干 代传代培养后逐渐死亡,该时间的长短取决于细 胞来源的种族和年龄。当细胞经自然的或人为的 因素转化为异倍体后,该细胞即可转变为无限细 胞系,或称连续细胞系。此时细胞的寿命将是无 限的,因此更适合
4、于工业化生产的需要。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点 动物细胞对周围环境十分敏感 动物细胞比植物细胞的培养难度大得多,因 为动物细胞膜外没有细胞壁保护,仅有一层很薄 的粘多糖蛋白。因此动物细胞对渗透压、pH、离 子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱 。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点 动物细胞对周围环境十分敏感 动物细胞比植物细胞的培养难度大得多,因 为动物细胞膜外没有细胞壁保护,仅有一层很薄 的粘多糖蛋白。因此动物细胞对渗透压、pH、离 子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱 。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点 动物细胞对培养基
5、的要求高 动物细胞对营养的要求高,不仅需要12种必 需氨基酸,还需要多种细胞因子和贴壁因子等才 能生长,这种要求还随细胞种类的不同而不同。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点 动物细胞蛋白质的合成和修饰功能与细菌不 同 动物细胞相对于原核细胞,它们多半是分泌 在胞外的,收集纯化方便,得到了较完善的翻译 后修饰,特别是糖基化,因此更与天然的产品一 致,更适合于临床使用。,一、动物细胞的形态和生理特点,一、生产用动物细胞的获得 原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织、器官,经过 粉碎、消化而获得的细胞悬液。,二、生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的获得 二倍体细胞系 原代细
6、胞经过传代、筛选、克隆,从而从多 种细胞成分的组织中挑选并纯化某种具有一定特 性的细胞株。该细胞株仍具备“正常”细胞的特点 : 它的染色体组型仍是2n的核型;具有明显 的贴壁依赖和接触抑制的特性; 只有有限的增 值能力,一般可连续传代培养50代; 无致瘤性,二、生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的获得 3. 转化细胞系 这类细胞是通过某个转化过程形成的,他常 常由于染色体的断裂变成了异倍体,从而失去了 正常细胞的特点,而获得了无限增值的能力。由 于转化的细胞具有无限生命力,而且常常倍增时 间较短,对培养条件和生长因子等要求较低,故 更适于大规模工业化生产的需要。,二、生产用动物细胞
7、的要求和获得,二、常用生产用动物细胞的特性 WI-38:二倍体细胞系。该细胞是最早被认为是 安全的传代细胞。在20世纪60年代广泛用于制备 疫苗。 MRC-5:二倍体细胞系。被广泛用于人体疫苗的生 产。 CHO-KI:1957年从中国地鼠暖巢中分离的一株上 皮样细胞,培养时需要加入脯氨酸。当前被广泛 用于构建工程菌的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的 营养缺陷突变株CHO-dhfr-。,二、生产用动物细胞的要求和获得,二、常用生产用动物细胞的特性 BHK-2:二倍体细胞系。用于增值病毒和工程细 胞的构建。 Vero:贴壁依赖型的成纤维细胞。支持多种病毒的 增值,已被批准用于人体。 Namalwa:转化
8、细胞系。被大规模地用于生物素 干扰素。 SP2/0-Ag14:被广泛用于单克隆抗体杂交瘤细胞 的制备和抗体的生产,近年来正被开发为生产其 它药品的高表达宿主细胞。 Sf-9:目前被广泛用于高效表达外来的蛋白制品。,二、生产用动物细胞的要求和获得,三、基因工程细胞的构建和筛选 真核细胞基因表达载体的构建 要将外源基因在动物细胞中高效表达,首先要 将其构建在一个高效表达载体内。目前,一般使用 的载体有两类:一类是病毒载体,如牛痘病毒、腺 病毒、逆转录病毒和杆状病毒。另一类是质粒载体 ,而且常常是穿梭质粒载体。,二、生产用动物细胞的要求和获得,三、基因工程细胞的构建和筛选 基因载体的导入和高效表达工
9、程细胞株的筛选 载体构建后,可用四种方法导入动物细胞,其 中最常用的是磷酸钙沉淀法和电穿孔法,各种常用 的方法见后表。,二、生产用动物细胞的要求和获得,表 DNA导入动物细胞的常用方法,二、生产用动物细胞的要求和获得,四、细胞库的建立 除原代细胞外,其他的细胞株、细胞系,无论 是二倍体细胞、转化细胞、还是融合细胞或经重组 的工程细胞,一旦建立后都需建细胞库加以保存。 按我国和美国FDA的规定,用于生产额工程细胞必 须建立两个细胞库,即原始细胞库(master cell bank , MCB)和生物用细胞库(manufacturers working cell bank, MWCB),或称工作细
10、胞库(working cell bank, WCB)。,二、生产用动物细胞的要求和获得,营养成分 促生长因子 激素 渗透压 pH 无毒、无污染,三、动物细胞的培养条件和培养基,培养基的基本要求,1.营养成分 氨基酸 氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必 须氨基酸: 缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。 此外还需要谷氨酰胺,它在细胞代谢过程中有中有重要作 用,所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源,同样也是合成 三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。 单糖 培养基中的细胞可以进行有氧与无氧酵解,六碳糖是主要 能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。 细胞
11、对葡糖糖的吸收能力最高,半乳糖最低。,1.营养成分 生长因子 主要是辅酶、辅基,必不可少。生物素、叶酸、烟酰 胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基 常有的成分。 无机离子与微量元素 细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素, 还需要微量元素,如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。,培养基的基本要求,培养基的基本要求,2.促生长因子及激素 各种激素、生长因子的功能 维持细胞的功能。 保持细胞的状态(分化或未分化) 有些激素对许多细胞生长有促进生长作用,如胰岛 素,它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。 有些激素对某一类细胞有明显促进作用,如氢化可的 松促进表面细胞的生长,泌乳素有促
12、进乳腺上皮细胞生长 作用等。,培养基的基本要求,3.渗透压 细胞必须生活在等渗环境中,大多数培养基细胞对渗 透压有一定耐受性。 人血浆渗透压290 mOsm/kg,可视为培养人体细胞的 理想渗透压。鼠细胞渗透压在320 mOsm/kg 左右。 大多数哺乳动物细胞,渗透压在260320 mOs/kg 的范 围都适宜。,培养基的基本要求,4. pH 大多数细胞适宜 pH为7.27.4 培养基应具一定的缓冲能力 造成pH波动主要是代谢产生的CO2,在封闭培养过程中 CO2与水结合产生碳酸,培养基pH很快下降。 为解决这一问题,合成培养基中使用了Na2CO3-CO2缓冲 系统,通过稳定调节温箱中CO2
13、浓度(5%),使之与培养箱 中的Na2CO3处于平衡状态。,培养基的基本要求,5. 无毒、无污染 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有任何抵抗能力。因此培养基应达到 无化学物质污染 无微生物污染(如细菌、真菌、支原体、病毒等) 无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染(如抗体、补体) 对于天然培养基,污染主要来源于取材过程及生物材料本身,应当严格选材,严格操作。 对于合成培养基,污染主要来源于配置过程,配置所用的水,器皿应十分洁净,配置后应严格过滤除菌。,培养基的基本要求,天然培养基 血清的种类 血清的主要成分和作用 血清的质量标准 血清的外观 血清的使用与储存 使用血清的优缺点,天然培
14、养基 天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。 但是由于天然培养基的制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基所替代。 目前广泛使用的培养基是血清,另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。,天然培养基,血清的种类 小牛血清 取自出生1030天的小牛 新牛血清 取自出生24小时之内的新生牛 胎牛血清 取自剖腹产的胎牛,血清中所含的抗体、 补体等对细胞有害的成分最少,天然培养基,血清的主要成分和作用 主要成分 血清是由血浆去除纤维蛋白质而形成的,血清中含有各 种血浆蛋白、多肽。脂肪、碳水化合物、生长因子、
15、激素、 无机盐等。 主要作用 提供基本营养物质 提供激素和各种生长因子 提供结合蛋白 对培养中的细胞起到某些保护作用,天然培养基,血清的质量标准 血清质量高低取决于两方面因素:一是取材对象,而是 取材过程。 理化性质 渗透压、pH、蛋白质电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒 素等。 蛋白含量包括血清总蛋白含量(不低于35-45g/L)、球蛋白 含量(应小于20g/L)、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量 是一项非常重要的指标。 血清中球蛋白主要是抗体,球蛋白含量越低血清质量越高, 血红蛋白也是越低越好。,天然培养基,血清的质量标准 微生物检测 包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检
16、测 支原体是一种很小的微生物,可通过孔径22m的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉,细胞也能生长繁殖,但会影响试样结果。 检测支原体的方法很多,如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。,天然培养基,血清的质量标准 促生长效果 这是血清重要的特性之一,应以培养的 细胞来检测 克隆形成率 悬浮生长的细胞,有限稀释法,统计克 隆生长百分比 贴瓶率测定 贴壁细胞,集落数占接种细胞数的百分 比 继传代培养 细胞培养七天收集细胞,计数,去平均 值。连续测试三个周期以上,观察细胞 生长状况。,天然培养基,血清的外观 好的血清应该是透明清亮,土黄色或棕黄色,无沉淀或极少沉淀,比较粘稠。 如血清
17、浑浊、不透明、含许多沉淀物,说明血清污染物或血清中的蛋白质变性 若血清呈棕红色,说明血清中的血红蛋白含量太高,取材时有溶血现象 摇晃时感觉液体稀薄,说明血清中掺入的生理盐水太多。,天然培养基,血清的使用与储存 使用前处理 灭火处理,即56 30分钟。灭活的目的是去除血清中 的补体成分。 储存条件 血清一般储存在-20 ,同时应避免反复冻融。购买大 包装的血清后首先要灭活处理,然后分装成小包装,储存于 -20 ,使用前融化。融化时最好先置于4 。融化后的血 清在4不宜长时间存放,应尽快使用。 使用浓度 自从有了合成培养基,血清就是作为一种添加成分与合 成培养基混合使用,使用浓度一般为520%,最
18、常用是10%。,天然培养基,使用血清的优缺点 牛血清的优点 来源充足 制备技术成熟 经过长时间的应用考验人们对其比较深入的理解 细胞培养中使用血清的缺点 改变某种细胞在体内的正常状态 含有一些对细胞会产生毒性的物质 每批血清都有差别,其成分不能保持一致 取材过程有可能带入支原体、病毒,天然培养基,基本培养基 如何选择培养基 培养基的配制 无血清培养 无蛋白培养基 限定化学成分培养,合成培养基,合成培养基是人工设计、配制的培养基。 早期组织培养是利用天然培养基,目前合成培养基已经成 为一种标准化的商品,从最初的基本培养基发展到无血清 培养基、无蛋白培养基,并且还在不断发展。 合成培养基的出现极大
19、促进了组织培养技术的普及发展。,合成培养基,基本培养基 基本组分 无机盐 CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4 氨基酸 缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱 (L型) 维生素 偏多酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄 素、硫胺素 碳水化合物 葡萄糖 除了以上与细胞生长有关的物质外,培养基中还要加入一种pH指示剂 酚红(当溶液酸性时pH小于6.8呈黄色;当溶液碱性时pH大于8.4呈红 色),合成培养基,基本培养基 种类 MEM 仅含12种必需氨基酸、谷氨酰胺,8种维生素及必要 的无机盐,由于成分简单,易于添加某种特殊成分适于某 些特殊细
20、胞培养 DMEM (Dulbeccos modified Eagle medium) 在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各 种成分用量,分高糖型(低于4500g/L)和低糖型(低于 1000g/L)高糖性有利于细胞停泊于一个位置生长,适于生 长较快、附着较困难的肿瘤细胞。,合成培养基,基本培养基 种类 IMDM(Iscoves modified Dulbeccos medium) 含有42种成分,与DMEM比较增加了许多非必须氨基酸 及一些维生素,增加了HEPES,葡萄糖含量为高糖性。适合 细胞密度较低、细胞生长困难的情况,如细胞融合之后杂交 细胞的筛选培养,DNA转染后转化细胞
21、的筛选培养。 RPMI1640 其组分较为简单,适合许多种细胞生长,如肿瘤细胞、正 常细胞、原代培养、传代培养等。是目前应用最为广泛的培 养基之一。,合成培养基,如何选择培养基 选择培养基没有一定的标准,有几点建议可供参考; 建立某些细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献,或在购买细胞株时咨询。 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640;进行细胞杂交、基因转移实验,可选择IMDM。 用多种培养基培养目的细胞,观察其生长状态,可以用生长曲线、集落形成率等指标判断,根据实验结果选择最佳培养基,这是最客观的方法。,合成培养基,培养基的配置
22、 目前在国内市场主要是干粉型,应正确配置,才能保证培养质量。配制培养基要注意以下问题: 认真阅读说明书。说明书都标注干粉不包含的成分,常见的有NaCO3谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的,有些是根据实验需要决定的。 配制是要保证充分溶解,NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。 配制所用的水应是双蒸水或三蒸水,离子浓度很低,三蒸水最佳。 所用器皿应严格消毒。 配制好的培养基应马上过滤除菌,无菌保存于4 。,合成培养基,无血清培养基 无血清培养基即不需要添加血清就可以维持细胞在体外 较长时间生长繁殖的合成培养基。 虽然基础培养基加少量血清所配制的完全
23、培养基可以满 足大部分细胞培养实验的要求,但对有些实验却不适合,如 观察一种生长因子对某种细胞的作用。这时需要排除其他生 长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种各种生长因子; 又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、 生长因子)的能力;或者更大规模的培养某种细胞,以获得 它们的分泌物。,合成培养基,无血清培养基 无血清培养基的基本配方 基础培养及添加组分两大部分。基础培养液以HamF12和 DMEM最为常用,一般1:1混合。 添加组分包括以下几大类物质: 促贴壁物质 贴壁细胞,无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子 促生长因子及激素 针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细
24、胞 生长、维持细胞功能的重要物质,有些激素是许多细胞必不 可少的,如胰岛素。,合成培养基,无血清培养基 无血清培养基的基本配方 酶抑制剂 培养贴壁生长的细胞,需要用胰酶消化传代,在无血清 培养基中必不可少须含酶抑制剂,以终止酶的消化作用,达 到保护细胞的目的,最常用的是大豆胰酶抑制剂。 结合蛋白和转运蛋白 转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较 大,可增加培养基的粘度,保护细胞免受机械损伤。许多旋 转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。 微量元素硒是最常见的。,合成培养基,无蛋白培养基(protein free medium,PFM) 无蛋白培养基即不含有动物蛋白的培养基。 无血清
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