掌握层析CHROMATOGRAPHY的概念.ppt
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1、层 析,CHROMATOGRAPHY,掌握:层析的概念、一般原理 凝胶层析的基本原理 装层析柱的过程及装柱要求 熟悉:层析技术的分类 凝胶层析的特点 凝胶的结构与性质 了解:凝胶的选择 柱、样品、洗脱液的选择 凝胶的保存,一.概述,层析Chromatography(色谱),利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等) ,使各组分在支持物上集中分布在不同区域,借此将各组分分离。,色谱历史,古罗马人分析混合染料(类似辐射纸色谱),1903(1906)年,Michael Tswett提出色谱法 1931年,Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素
2、 1941年,Martin和Synge提出分配色谱法 1944年,Martin等又提出纸色谱法 1952年,Martin和James发明了气液色谱法 1955年,第一台商品气相色谱问世,标志着现代色谱分析的建立 1956年,Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC),1958年,Stein和Moore研制出氨基酸分析仪,确定了核糖核酸的分子结构 1967年,Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)仪 1975年,Small等提出离子色谱 20世纪80年代,超临界色谱 20世纪90年代,毛细管电泳(1
3、809年Ress第一次电泳实验) 21世纪,联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展,层析法进行时有两个相,一个相称为固定相(Stationary phase ),另一相称为流动相(Mobile phase )。由于各组分所受固定相的阻力和流动相的推力影响不同,各组分移动速度也各异,从而使各组分得到分离。,二.层析技术的分类,1. 按两相所处的状态分类 以液体作为流动相的层析称为液相层析,以气体作为流动相的称为气相层析。 其固定相也可有两种状态,一种是以固体作为吸附剂的固定相,另一种是以涂布在固体载体表面的液体作为固定相。,层析,气相层析(gas-chromatography),液
4、相层析(liquid-chromatography),气-固层析(gas-solid chromatography),气-液层析(gas-liquid chromatography),液-固层析(liquid-solid chromatography),液-液层析(liquid-liquid chromatography),2.按层析过程的机制可分为 .吸附层析(adsorption chromatography ) -利用吸附剂对不同组分吸附 能力的不同加以分离的方法。 .分配层析(partition chromatography ) -利用不同组分在流动相和固定相中的 分配系数不同而进行分
5、离的方法。,.离子交换层析 (ion-exchange chromatography ) -利用离子交换剂与各组分之间的离子亲和 力不同而进行层析分离的方法。 .凝胶层析(gel chromatography) -利用不同组分之间分子大小不同,在通过凝胶介质时所受到的阻滞作用的差异而进行分离的方法。 .亲和层析(affinity chromatography) -利用生物大分子之间特有亲和力的不同进分离纯化的方法。,3.按操作技术形式分类 .柱层析(colum chromatography) -将固定相装在层析柱中,使样品 朝着一个方向移动,通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。,纸层析(p
6、aper chrmatography) -用纸作为液体的载体,样品点在 纸上随后展开达到分离鉴定的 方法。 .薄层层析(thin layper chromatography) -将适当的吸附剂在玻璃板或 其他材料薄板上铺成薄层,样品 点在上面随后用流动相展开达 到分离鉴定的方法。,三.层析的一般原理,1.分配系数 (Partition chromatography) 混合物在层析过程中不管层析技术采用哪两种状态的相(流动相和固定相)都能达到分配平衡,用来叙述一种物质在两种特定相中的分配程度是用分配系数表示的。,分配系数-是一种物质在两种特定相中分配,在特定的温度时这个系数的值是一个常数,即:
7、溶质在固定相中的浓度 Cs K= = 溶质在流动相中的浓度 Cm,有效分配系数:定义为化合物在一个相的总量除以另一个相中的总量。实际上是分配系数乘以两个相的体积比。 在不同的层析机制中,分配系数K的含义不同,在吸附层析中,K为吸附平衡常数;在分配层析中,K为分配系数;在离子交换层析中K为交换常数.,分配系数K值大,说明物质在层析中被固定相吸附得比较牢固,随流动相迁移的速度较慢,留在固定相中的时间较长,在洗脱液中后出峰。若分配系数K值小,则该物质在洗脱液中较早出峰。,从一个混合物中分离和纯化一种生物物质的纯度如何,取决于混合物中各组分K 值的差异程度。 混合物中各组分若 K值相差较大, 则能较易
8、地把混合物中的生物物质分离。反之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物质分离。,2.讨论层析中的移动情况 通常采用平衡过程的研究方法,把层析柱划分为若干连续部分,每个体系都达到平衡。 理论板数(n):在层析柱上,溶剂连续不断加入,化合物在流动相和固定相中不断分配平衡,所发生的平衡次数称为理论板数。,凝胶层析 Gel Chromatography,一、定义,凝胶层析是按照被分离物质分子大小,经过具有一定孔径的多孔物质进行分离的一种方法。其又称为凝胶过滤或分子筛过滤或排阻层析。,主要机理是分子筛效应,当被分离物质流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶
9、柱中的迁移速度不同得到分离。,二.基本原理,流动相(洗脱液) 固定相(凝胶) 原理:被分离物质中各组分的分子量不同 。,进入具有一定孔径的凝胶柱后,较大的分子不能进入凝胶孔隙中,被排阻在外,而较小的分子则能进入凝胶孔隙,加入洗脱剂后,大分子就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来,受到的阻力小,其流速较快,小分子物质从上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中,这样多次反复,大分子物质先从柱中流出,小分子物质后流出 。,小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留,大分子被排阻在凝胶颗粒外面,在颗粒之间迅速通过。,凝胶层析过程的数理关系,柱床体积(VT) 即凝胶体积以及颗粒 内外间隙体积的总和。 VT =
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