生物制药细胞工程单克隆抗体.ppt
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1、Emil von Behring, 1901, antitoxins,Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody,Susumu Tonegama,1987, structure of Ig gene,Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody,Paul Ehrlich , 1908, production of antibody,Nobel Prize winners,发明单克隆抗体技术 Nobel Prize in 1984,抗体发展
2、的三个阶段,单克隆抗体,基因工程抗体,多克隆抗血清,传统抗血清,抗 原,免 疫,所有抗体混合,1,2,3,4,脾 脏,淋巴結,B 細胞,细胞工程杂交瘤技术,鼠单抗,人单抗,大鼠,小鼠,产量高、操作比小鼠麻烦 少用,易操作、多用,HAMA反应,人人杂交瘤,人B细胞、骨髓瘤细胞融合,人鼠杂交瘤,人B细胞、鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤制备人单抗的问题:染色体易丢失、抗体分泌不稳定,美国已上市16种单克隆抗体药物 2002年销售额 29亿美元 2005年 90亿美元 我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段。,2002年完全人源化单抗humira获得批准上市,这是单克隆抗体药物发展具有里程碑意义大事,预示着
3、单克隆抗体药物一个迅猛发展的新时代的来临。Humira是Abbott/CAT公司开发的一种治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物。,Avastin 是美国刚刚上市的治疗结肠癌的抗体药物,也是第一个从抗体库中筛选出的 Fab 段抗体药物。 Avastin的上市使公司的股价上升了90亿美元。,抗血小板凝集的原理图,抗体药物销售趋势图,全球有超过200家上市或未上市公司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体 正在进行临床试验的抗体公司(38家):,Abgenix Alexion Pharm Altarex Applied Molecular Evolution BASF Biogen BioTranspl
4、ant CAT(Cambridge Ab Tech) Celltech Centeon Centocor (Johnson & Johnson),Elan Elsai Eli Lilly Genzyme Transgenics Genentech Genmab Hoffman-La Roche ICOS Pharm IDEC Pharm/Mitsubishi ImClone Sys Immunotech Kanebo Knoll Pharm,LeukoSite Medarex Medimmune Norvartis Ortho Biotech Pasteur-Merieux Progenics
5、 Protein Design Lab Schering SmithKline Beecham Tanox Biosystems Techniclone Xoma Zenyaku,Monoclonal Antibodies on the Market,Monoclonal Antibodies on the Market,抗体 是对其抗原有极强专一性 的 魔弹 或 巡弋飞弹,研 究 以免疫转印法检测 特定抗原 医 疗 以毒素连结抗体攻击 病变細胞 检 验 以 ELISA 侦测特定 病原体,SDA批准进入临床的体内诊断用抗体,131I-抗人肝癌单克隆抗体(HAb18、Hepama-1) 99mT
6、c-抗人小细胞肺癌单克隆抗体(2F7),SDA批准进入临床的治疗用单抗,抗T细胞免疫毒素 抗C-ALL免疫毒素 131I-抗肝癌单克隆抗体 抗人CD25单克隆抗体 抗乙脑单克隆抗体 抗流行性出血热抗体 抗人CD3单克隆抗体 抗人IL-8单克隆抗体,抗体治疗疾病的机制,抗原失活 免疫效应细胞吞噬 抗原表面弱化易受补体破坏,单抗研发的演变历程,鼠单抗 100% 鼠源 OKT-3 Panorex Zevalin,鼠/人嵌合单抗 (66-75 % 人源) ReoPro, Rituxan Remicade Simulect,人源化单抗 (90-95 % 人源) Zenapax, Mylotarg, He
7、rceptin, Campath Synagis,100% 人源,抗体攻击病毒,凝集细菌,抗 SARS 的单抗,SARS-CoV,抗体生成技术,Epitope, Antigenic determinant,抗原決定基, 一个抗原分子上可能有数个抗原決定基, 每個 抗原決定基 至少誘生一種專一性抗体, 蛋白质性 抗原決定基 含有六个以上氨基酸,整体水平抗体生成技术,细胞工程抗体生成技术,基因工程抗体生成技术,多克隆抗体(抗血清),单克隆抗体,嵌合抗体、改形抗体,“小型化抗体”(单链抗体),组合抗体库技术,噬菌体抗体库技术,Ig基因转基因小鼠,抗体真核表达技术,1 多克隆抗血清,对健康人用疫苗进行
8、主动免疫,免疫前(a)和免疫后10天 (b)分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的g 球蛋白条带较宽,免疫之后则相对集中。Bruton 氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺失(c)。,a1,a2,b,g,白蛋白,球蛋白,(c),(a),(b),来源: 组织和细胞,其成分比较复杂。 1.组织和细胞成分混合抗原制备 2.蛋白质抗原制备 3.核酸抗原制备 4.类脂多糖抗原制备 5.免疫球蛋白片段制备 6.纯化抗原的鉴定,二、可溶性抗原制备及鉴定,可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、 补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸,可溶性抗原制备及鉴定,返回,组织和细胞成分混合抗原制备程序,上清液
9、澄清,所用材料必须是新鲜或低温保存的,去除包膜或结缔组织,脏器进行灌洗,洗去血迹 及污物,NS内含0.5gL NaN2,冷浴中组织剪碎,装入捣碎机简内高速 粉碎制成组织匀浆液,3000rmin10min,取上清液,去除细胞碎片 及微小组织,离心,绵羊红细胞的制备流程图,摇动 15-20min,4,可保存3周,取适量,NS洗涤3次 2000r/min 10min,NS稀释至 25%,细菌细胞抗原的制备流程图,液体培养或 斜面培养 3724h,100水浴 22.5h 杀菌,无菌试验,NS稀释成810亿/ml,O菌体抗原,返回,杂交瘤技术过程,多克隆抗体,多克隆抗体(polyclonal antib
10、ody) 指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。 如:免疫血清(含多种特异性抗体)。 实际意义: (1)预防、治疗感染性疾病, 如:破伤风抗毒素血清 抗破伤风, 胎盘球蛋白 抗病毒感染等 副作用:超敏反应 (2)临床诊断,如:肥达氏反应 - 伤寒、副伤寒 缺点:特异性差。,多价抗原,单克隆 (致敏的B细胞),单克隆抗体,单克隆抗体,传统抗血清的交叉反应,专一性反应,沒有反應,交叉反应,+,-,?,1 2 3 Ag A,x y z Ag B,1 2 0 Ag A,可生产有用抗体的 淋巴細胞 若与 癌细胞融合,则形成稳定而可培养的细胞株。,癌细胞 可培养生长,浆细胞
11、 B cell 可分泌抗体,融合瘤 Hybridoma,细 胞 融 合,两组染色体混在一起,也可以培养生長 产生专一性抗体,一個 B cell 只 产生一种抗体, 一个 B 细胞只能生产一种抗体,对付某一 抗原決定基。, 若有许多抗原決定基,则需许多株 B 細胞分別生产许多抗体。,B,B,B,Y,Y,Y,Y,抗 原,B,Y,B,亲和力成熟,1,1,2,3,4,抗原決定基,1,2,3,4,1,2,3,4,单抗,细胞融合,取出脾細胞,+ 癌細胞,各抗体分开,1,2,3,4,m,核酸补救合成,m,核酸从头合成,核酸,氨甲喋呤(A),(-),次黄嘌呤(H)胸苷(T),TK,HGPRT,TK-,HGPR
12、T-,抗体,-a,-b,-c,-d,-a -b -c -d,BALB/c,a,b,b,c,d,传统抗体 (抗血清) 是所有抗体的混和,脾脏产生各种 B 細胞,免疫前要先 把抗原作 成乳剂,免疫,抗原,采血后可得传统抗血清,已建立之小鼠 骨髓癌细胞株,由脾脏收集 B 細胞,抗原通常有多个抗原決定基,免疫后 的脾脏,约在两月內 注射五到八次,Ag X,细胞融合,Ag X,Ag X,ELISA,HAT,PEG Cell fusion,Hybridoma cells 融合瘤细胞,(Subcloning) (确定只有一种细胞),d,d,a b c d,a b c d,+ + + +,+ + + -,X,
13、-d,-c,-b,-a,+,-,-d,分株培养筛选,筛选,单抗,传统抗体 (抗血清),试验专一性,对 抗 原 的 反 应,无 法 分 辨,完 全 不 同,抗体的结构,1 小分子抗体,3 鼠单抗人源化,基因工程改造的抗体,2,(1) 小分子抗体,1,2,3,小分子抗体,Fab:抗原结合片断 Fv:可变区片段 ScFv:单链可变区片段 SdAb:单区抗体,免疫球蛋白 基因载体的构建,H链表达载体,L链表达载体,共转染细胞,Pr VH CH1 Pr VL CL,图5 Fab 抗体分子的制备,I Fab antibody molecule,抗体分泌细胞,VH,VL,CL,-S-S-,CH1,图5 Fa
14、b 抗体分子的制备,II Fv antibody molecule,双特异性抗体,抗原A,抗原B,-S-S-,Fab,VH,CH1,VL,-S-S-,CH1,VH,VL,Fv,VH,VL,许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点,使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起,可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别,取得杀伤肿瘤细胞的作用。,CTL,CD3,TUMOR CELL,-S-S-,VH,CH1,VL,-S-S-,CH1,抗原A,抗原B,(2) 抗体融合蛋白,抗原结合部位与生物活性蛋白结合 含Fc段的抗体融合蛋白免疫黏
15、附素 Fc的作用:检测、纯化、 延长血清中半寿期 生物学效应功能,G-CSF,Fc,Fusion Protein,DNA ligation,expression,Fc的作用:延长血清中半寿期,(3) 鼠单抗人源化,将小鼠Ig基因敲除,转染人Ig基因,在小鼠体内产生人Ab,再经杂交瘤技术,产生大量完全人源化抗体 恒定区人源化人-鼠嵌合抗体 可变区人源化人改型抗体 用抗体库技术进行人源化,鼠单抗人源化,Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL,免疫球蛋白 基因载体的构建,H链嵌合载体,L 链嵌合载体,共转染细胞,启动子,人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略,鼠VH,鼠VL,人CL,人CH,抗体分泌
16、细胞,人-鼠嵌合基因工程抗体,定义:指利用基因工程技术,将人抗体可变区(V)中互补决定簇(CDR)序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”,因其主要涉及CDR的“移植”,又可称为“CDR移植抗体 意义:多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗,人改型抗体(CDR移植),人源化抗体又称CDR移植抗体,CDR序列,CDR序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体,图4 鼠单克隆V区人源化(CDR移植),抗体库技术,抗体库在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire),三 基因工程方法研制新的单抗,抗体库技术产生的三项技
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