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1、第三章 核酸化学,主要内容:介绍核苷酸和核酸的分类和化学组成,重点讨论DNA和RNA的结构特征,初步认识核酸的结构特征与其功能的相关性;介绍核酸的主要理化性质和核酸研究的一般方法。,返回,思考,目 录,第一节 核酸概述 第二节 核酸基本构件单位核苷酸 第三节 DNA的分子结构 第四节 RNA的分子结构 第五节 核酸的理化性质 第六节 基因和基因组 第七节 DNA超螺旋和染色体结构,第一节 核酸概论,一、核酸的研究历史和重要性 二、核酸的种类和分布 三、DNA储存遗传信息的证实,核酸分类和分布,脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA):遗传信息的贮存和携带者,生物的主
2、要遗传物质。在真核细胞中,DNA主要集中在细胞核内,线粒体和叶绿体中均有各自的DNA。原核细胞没有明显的细胞核结构,DNA存在于称为类核的结构区。每个原核细胞只有一个染色体,每个染色体含一个双链环状DNA。 核糖核酸(ribonucleic acid, RNA):主要参与遗传信息的传递和表达过程,细胞内的RNA主要存在于细胞质中,少量存在于细胞核中,病毒中RNA本身就是遗传信息储存者。另外在植物中还发现了一类比病毒还小得多的侵染性致病因子称为类病毒,它是不含蛋白质的游离的RNA分子,还发现有些RNA具生物催化作用(ribozyme)。,核酸的研究历史和重要性, 1869 Miescher从脓细
3、胞的细胞核中分离出了一 种含磷酸的有机物,当时称为核素(nuclein),后称为核酸(nucleic acid);此后几十年内,弄清了核酸的组成及在细胞中的分布。 1944 Avery 等成功进行肺炎球菌转化试验;1952年Hershey等的实验表明32P-DNA可进入噬菌体内, 证明DNA是遗传物质。 1953 Watson和Crick建立了DNA结构的双螺旋模型,说明了基因的结构、信息和功能三者间的关系,推动了分子生物学的迅猛发展。 1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则, 60年代 RNA研究取得大发展(操纵子学说,遗传密码,逆转录酶)。,核酸的研究历史和重要性(续)历史, 70
4、年代 建立DNA重组技术,改变了分子生物学的面貌,并导致生物技术的兴起。 80年代 RNA研究出现第二次高潮:ribozyme、反义RNA、“RNA世界”假说等等。 90年代以后 实施人类基因组计划(HGP), 开辟了生命科学新纪元。生命科学进入后基因时代: 功能基因组学(functional genomics) 蛋白质组学(proteomics) 结构基因组学(structural genomics) RNA组学(Rnomics)或核糖核酸组学(ribonomics),第二节 核酸的基本结构单位核苷酸,一、核苷酸的化学组成与命名 1、碱基、核苷、核苷酸的概念和关系 2、常见碱基的结构与命名法
5、 3、常见(脱氧)核苷酸的基本结构与命名 4、稀有核苷酸 二、核苷酸的生物学功能 三、磷酸二酯键和多核苷酸,5-磷酸核苷酸的基本结构,(N = A、G、C、U、T),H,H,(O)H,1,2,N,OH,CH2,H,H,5,4,3,P,O-,O,O,O-,核糖,磷酸,碱基,碱基、核苷、核苷酸的概念和关系,Nitrogenous base,Pentose sugar,Phosphate,基本碱基结构和命名,嘌呤,嘧啶,Adenine (A),Guanine (G),Cytosine (C),Uracil (U),Thymine (T),核苷酸的结构和命名,腺嘌呤核苷酸( AMP) Adenosin
6、e monophosphate,脱氧腺嘌呤核苷酸(dAMP) Deoxyadenosine monophosphate,H,OH,常见(脱氧)核苷酸的结构和命名,鸟嘌呤核苷酸(GMP),尿嘧啶核苷酸(UMP),胞嘧啶核苷酸(CMP),腺嘌呤核苷酸(AMP),脱氧腺嘌呤核苷酸(dAMP),脱氧鸟嘌呤核苷酸(dGMP),脱氧胞嘧啶核苷酸(dCMP),脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP),几种稀有核苷,假尿苷(),O2-甲基腺嘌呤核苷,N6-二甲基腺嘌呤核苷(m26A),二氢尿嘧啶(DHU)核苷,H,H,H,H,5,CH3,CH3,H3C,二 、核苷酸的生物学功能,作为核酸的单体 一些多磷酸核苷酸是细胞中
7、的携能物质 (如ATP、GTP、CTP、GTP) 一些核苷酸是许多酶的辅助因子的结构成分 一些核苷酸细胞通讯的通讯媒介 (如cAMP、cGMP、ppGpp),三磷酸核苷酸 5-NMP 5-NDP 5-NTP N=A、G、C、U,腺苷酸及其多磷酸化合物,高能化合物(脱氧)三磷酸核苷酸,cAMP(cGMP)的结构,Cyclic adenylie (Guanine)acid,核酸分子中核苷酸之间的共价键,3 -5 磷酸二酯键,第三节 DNA的分子结构,一、DNA 一级结构 二、DNA碱基组成的特点和规律 三、DNA的二级结构,肺炎球菌转化实验图解,R型细胞(无毒),破碎细胞,R型细胞接受S型DNA,
8、大多数仍为R型,少数 R型细胞被转化产生S型荚膜,S,R,+,DNA,证实DNA储存遗传信息的实验之一,DNAase降解后的DNA,后代只有 R型,R,S型细胞(有毒),Hershey-Chase实验,放射性蛋白衣壳,32P实验,35S实验,非放射性细胞,放射性细胞,非放射性蛋白衣壳,放射性DNA,注射DNA,剪切搅拌使衣壳离开细菌细胞,离心作用使细胞与衣壳分离,非放射性DNA,细菌细胞,蛋白衣壳,DNA,一、DNA 的一级结构, DNA分子中各脱氧核苷酸之间的连接方式(3-5磷酸二酯键)和排列顺序叫做DNA的一级结构,简称为碱基序列。一级结构的走向的规定为53。不同的DNA分子具有不同的核苷
9、酸排列顺序,因此携带有不同的遗传信息。 一级结构的表示法 结构式,线条式,字母式,5,3,5,3,5,5,3,DNA一级结构的表示法,5,3,二、DNA碱基组成特点和规律,不同物种间DNA碱基组成一般是不同的; 一个给定物种的DNA碱基组成不因个体的年龄、营养状态和环境改变而改变 ; DNA碱基组成的Chargaff定则:腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等,即 A=T;鸟嘌呤和胞腺嘧啶的摩尔数也相等,即G=C;嘌呤的总数等于嘧啶的总数,即A+G=C+T。,DNA、RNA的一级结构,DNA一级结构,三、DNA的二级结构,(1) DNA的双螺旋结构(Watson-Crick模型) (2) DNA双螺旋结
10、构特征及意义 (3) DNA双螺旋的多态性 (4)其它DNA螺旋结构,James Watson,Francis Crick,DNA的双螺旋结构的形成,小沟,大沟,DNA的双螺旋模型特点,a. 两条反向平行的多聚核苷酸链沿一个假设的中心轴右旋相互盘绕而形成。 b. 磷酸和脱氧核糖单位作为不变的骨架组成位于外侧,作为可变成分的碱基位于内侧,链间碱基按AT,GC配对(碱基配对原则,Chargaff定律) c. 螺旋直径2nm,相邻碱基平面垂直距离0.34nm,螺旋结构每隔10个碱基对(base pair, bp)重复一次,间隔为3.4nm,碱基之间的氢键 碱基堆集力 磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离
11、子中和 碱基处于疏水环境中,DNA的双螺旋结构稳定因素,小沟,大沟,大沟,小沟,DNA的双螺旋结构模型的意义,DNA双螺旋结构模型的主要特征受到许多化学和生物学证据的支持,它揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征(碱基配对、双链互补、反向平行),这是是DNA复制、转录和反转录的分子基础,亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是本世纪生命科学的重大突破之一,它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。,DNA的局部构象,脱氧核糖五元环的折叠,核苷残基的顺式和反式,主链中单键的旋转,DNA双螺旋的不同构象,A-DNA,Z-DNA,D-DNA,C-DNA,B-DNA,三种DNA
12、双螺旋构象比较,A-DNA,Z-DNA,B-DNA,A B Z,外型 粗短 适中 细长,螺旋方向 右手 右手 左手,螺旋直径 2.55nm 2.37nm 1.84nm,碱基直升 0.28nm 0.34nm 0.37nm,碱基夹角 32.70 34.60 60.00,每圈碱基数 11 10.5 12,轴心与碱基对关系,2.46nm 3.32nm 4.56nm,碱基倾角 200 60 10,糖苷键构象 反式 反式 C、T反式,G顺式,大沟 很窄很深 很宽较深 平坦,小沟 很宽、浅 窄、深 较窄很深,DNA双螺旋三种不同的构象,A-DNA,Z-DNA,B-DNA,DNA的回文顺序(palindrom
13、e),5,3,3,5,回文结构(序列):指DNA序列中,以某一中心为对称轴,其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同的双螺旋结构,即对称轴一侧的片段旋转180后,与另一侧片段相重复。,DNA二级结构的多样性,二重旋转对称轴,DNA分子中十字形结构的形成,具有回文结构的多核苷酸链由于同一条链内有互补序列,因而在单链DNA或RNA中能形成发卡结构,在双链DNA内能形成十字型结构。,DNA二级结构的多样性,DNA二级结构的多样性,Holliday结构,Hoogsteen碱基配对,T-A-T,C-G-C,DNA分子间的三链结构,DNA二级结构的多样性,第四节 RNA的分子结构,一、RNA一级结构 和类别 二
14、、tRNA 的分子结构 三、mRNA的分子结构 四、rRNA的分子结构,RNA的一级结构,RNA分子中各核苷之间的连接方式(3-5磷酸二酯键)和排列顺序叫做RNA的一级结构,RNA与DNA的差异 DNA RNA 糖 脱氧核糖 核糖 碱基 AGCT AGCU 不含稀有碱基 含稀有碱基,2、其它RNA: 有催化活性的RNA (ribozyme,核酶) 有调节功能的RNA 如:反义RNA(antisense RNA) 非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA) ,如微RNA(micro RNA,miRNA)和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),RNA的
15、类别,1、与 遗传信息的传递和表达有关的RNA 信使RNA(messenger RNA,mRNA):在蛋白质合成中起模板作用; 核糖体RNA(ribosoal RNA,rRNA):与蛋白质结合构成核糖体(ribosome),核糖体是蛋白质合成的场所; .转移RNA(transfor RNA,tRNA):在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。,tRNA 的结构,二级结构特征: 单链 三叶草叶形 四臂四环,三级结构 特征: 在二级结构基础上 进一步折叠扭曲形成倒 L型,酵母tRNA Ala 的二级结构,3,5,tRNA的三级结构,DHU loop,TC loop,Anticodon loop,C
16、CA Terminus,5,3,rRNA的分子结构,特征:单链,螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能,5s rRNA的二级结构,mRNA的分子结构,原核生物mRNA特征: 先导区+翻译区(多顺反子)+末端序列 真核生物mRNA特征: “帽子”(m7G-5ppp5-N-3p)+单顺反子+“尾巴”(Poly A),原核细胞mRNA的结构特点,5,3,顺反子(cistron):核酸分子中为一条多肽链编码的区段,个顺反子实际上就是一个基因(gene),多顺反子mRNA(polycistronic mRNA ),真核细胞mRNA的结构特点,5 “帽子”,PolyA 3,单顺反子mR
17、NA(monocistronic mRNA),顺反子,第五节 核酸的理化性质,一、核酸的两性解离性质及核酸电泳 二、核酸的紫外吸收(max=260nm) 三、核酸的变性、复性和分子杂交 四、核酸的熔解温度(Tm) 五、核酸的沉降性质,核苷酸的解离曲线,pK1 = 0.8 第一磷酸基,pK3 = 6.3 第二磷酸基,pK2 = 4.3 含氮环,胞嘧啶核苷酸,pK1 = 1.0 第一磷酸基,pK3 = 6.4 第二磷酸基,烯醇式羟基,尿嘧啶核苷酸,pH,离子化程度,小牛胸线DNA的滴定曲线,核酸的两性解离性质及核酸的电泳,核酸分子中既有碱性基团,又含有磷酸基团,因磷酸的酸性强,核酸在生理pH条件下
18、表现为酸性。 核酸在一定pH的缓冲溶液中带有电荷,因此可以利用电泳的方法对其进行分离和并研究其特性。,DNA的紫外吸收光谱,天然DNA 变性DNA 核苷酸总吸收值,1 2 3,220,240,260,280,0.1,0.2,0.3,0.4,波长(nm),光吸收,1,2,3,DNA的变性过程,加热,部分双螺旋解开 无规则线团 链内碱基配对,核酸的变性、复性和杂交,变性:在物理、化学因素影响下, DNA碱基对间的氢键断裂,双螺旋解开,这是一个是跃变过程,伴有A260增加(增色效应),DNA的功能丧失。 复性:在一定条件下,变性DNA 单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构,伴有A260减小(减色效应),
19、DNA的功能恢复。,DNA分子复杂度计算,此式表示DNA复性反应的初始浓度co与反应完成一半所需时间的乘积是个常数。 cot1/2或K亦称DNA的复杂度(complexity,C),K值因DNA分子量的增大而增大。,各种不同的DNA分子的复性动力学曲线,1,3500,1.7105,4.2106,基因组(bp),cot1/2=K,为DNA分子复杂度,是各物种DNA含量的一种衡量,100%,C0T1/2,复性部分,分子杂交的原理示意图,不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域,在复性时可形成局部双螺旋区,称核酸分子杂交 (hybridization) 制备特定的探针(pr
20、obe)通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。 实例:southern印迹法,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,Tm:熔解温度(melting temperature),DNA的变性发生在一个很窄的温度范围内,通常把热变性过程中A260达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度,用Tm表示。 Tm的大小与DNA分子中(G+C)的百分含量成正相关,测定Tm值可推算核酸碱基组成及判断DNA纯度。,1,2,3,沉降系数(S
21、),生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下,从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用Svedberg,即S表示,S=110-13秒。,沉降系数(S)与分子量(M)的关系,Svederg方程:,第六节 基因和基因组,染色体上为一条功能性多肽或一个RNA编码,以及规定各种基因选择性表达的信息的一个DNA片段称为基因(gene),一个细胞中所有基因和基因间的总和称为基因组(genome)。现在亦把能独立地传递遗传信息的的病毒DAN、质粒DNA或RNA分子称为病毒基因组和质粒基因组。 顺反子(cistron)是遗传学中定义的遗传单位,一个顺反子就
22、是为一条功能性多肽编码的基因。,一、DNA的碱基组成和序列特征 二、DNA序列的遗传信息,DNA的碱基组成和序列组织,碱基组成特点: a. A=T,G=C;(Chargaff规则) b. 同一物种GC含量相同,种间差异显著; c. 含有修饰化碱基,主要是甲基化; d. 原核生物碱基组成均匀,真核生物碱基组成显示出极大的不均匀性。,真核序列组织特点: a. 存在着四类序列:高度重复序列、中度重复序列、单一序列、反向重复序列 b. 大多数蛋白质基因和基因是割(断)裂基因,含有一些称为内含子(intron)而且转录后被切除的序列 c. 基因间存在着转录或不转录的间隔区; d. 存在着假基因(pseu
23、dogene),这些序列与真基因具高度的同源性,但由于突变而不能表达。,氯化铯中的浮力密度,光吸收,DNA主带1.700,卫星DNA,1.692(ACAAACT)n,1.688(AtAAACT)n,1.671(ACAAAtT)n,果蝇的卫星DNA(satellite DNA),DNA序列和遗传信息,反式行为因子(trans-acting-factor):规定各种蛋白质和RNA结构的信息,顺式行为元件(cis-acting-element):规定各种基因选择性表达的信息,DNA的核苷酸序列通过mRNA规定蛋白质的氨基酸序列,同时信息的转换还要通过蛋白质以外的因子,如tRNA、核糖体等来完成,储存
24、在DNA的精细结构中,直接表现为特定的空间结构,即“密码结构域”,通过DNA有关序列形成特异性结构与有关蛋白质因子结合来体现,思考:人类基因组计划(HGP)的重要研究结果之一是人类基因总数在3-3.5万个之间,远远低于原来估计的10万个,也远远少于其他一些生物,而人又是地球上最复杂最有智慧的生物,如何解释这个事实?,真核染色体的端粒(telomere),端粒是真核染色体的末端序列,由一段十分简单的串联重复序列组成,如人的端粒重复单位为TTAGGG,四膜虫为GGGGTT。端粒的生物学功能是保持染色体的稳定,它决定着细胞的寿命。,染色体DNA,G-四 联体,第七节 DNA的超螺旋和染色体结构,一、
25、DNA的拓扑学结构,拓扑学(topology):数学的一个分支,研究一种物体在不断变形情况下的某些不变的性质。,二、DNA在体内的包装和染色体结构,一、DNA的拓扑结构,1超螺旋DNA(supercoiled DNA),2原核生物拓朴异构酶(topoisomerase),(1) 超螺旋DNA的形成 (2) 超螺旋状态的定量描述 () DNA超螺旋结构形成的重要意义,(1) 拓朴异构酶I (2) 拓朴异构酶II,DNA的拓扑学结构指双螺旋DNA分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象,包括不同二级结构单元间的相互作用、单链和二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征。,螺旋和超螺旋电话线,螺旋,超螺
26、旋,L=23,T=23,W=0,解链环形,1,5,10,15,20,23,DNA超螺旋的形成,超螺旋的拓扑学公式: L=T+W 或 =+,链分开,超螺旋状态的定量描述,公式1: Lk=Tw+Wr Lk连系数(linking number),DNA双螺旋中一条链以右手螺旋与另一条链缠绕的次数(右手为“+”,左手为“-”) 。 (具有不同连系数的同一种DNA分子称为这种DNA分子的拓扑异构体) TwDNA双链的互相缠绕数(twisting number) Wr超螺旋数或螺旋轴的缠绕数(writhing number),公式2: =(Lk-Lk0)/Lk0 超螺旋度(degree of superc
27、oiling) Lk0 松驰态DNA连环数 Lk 超螺旋态DNA连环数,DNA超螺旋结构形成的意义, 使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中; 推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性,利于复制和转录。,原核生物两类拓扑异构酶,除连环数(L)不同外其他性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体(topoisomerase)。DNA拓扑异构酶通过改变DNA的L值而影响其拓扑结构。 拓扑异构酶I通过使DNA的一条链发生断裂和再连接,能使超螺旋DNA转变成松弛型环状DNA,每催化一次可消除一个负超螺旋,即使L增加,反应无需供给能量。 拓扑异构酶II则刚好
28、相反,可使松弛型环状DNA转变成负超螺旋DNA,每催化一次,L 减少,可引入负超螺旋。拓扑异构酶II亦称促旋酶,它可以使DNA的两条链同时断裂和再连接,当它引入超螺旋时需要ATP提供能量。 细胞内两类拓扑异构酶的含量受严格的控制,使细胞内DNA保持在一定的超螺旋水平。,原核拓扑异构酶I的作用机制,拓扑异构酶I通过使DNA的一条链发生断裂和再连接,能使超螺旋DNA转变成松弛型环状DNA,每催化一次可消除一个负超螺旋,即使L增加,反应无需供给能量。,原核拓扑异构酶II的作用机制,拓扑异构酶II可使松弛型环状DNA转变成负超螺旋DNA,每催化一次,L 减少,可引入负超螺旋。拓扑异构酶II亦称促旋酶,
29、它可以使DNA的两条链同时断裂和再连接,当它引入超螺旋时需要ATP提供能量。,DNA双链断裂,DNA双链穿过,重复起始,DNA的释放,DNA双链重新连接,二、DNA在体内的包装和染色体的结构,染色体(chromosome)的本质是病毒、细菌、真核细胞或细胞器中储存遗传信息的核酸分子。染色体中含有几乎等量的DNA和蛋白质,蛋白质的主要成分是组蛋白和少量作为调节因子的非组蛋白。 真核生物DNA和组蛋白形成核小体,再组装成染色体。细菌染色体DNA被压缩成“拟核”结构。,组蛋白和DNA结合成核小体,核小体盘绕及染色质示意图,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,DNA (2nm),核小体链( 11n
30、m,每个核小体200bp),纤丝( 30nm,每圈6个核小体),突环( 150nm,每个突环大约75000bp),玫瑰花结( 300nm ,6个突环),螺旋圈( 700nm,每圈30个玫瑰花),染色体( 1400nm, 每个染色体含10个玫瑰花200bp),从DNA到染色体,细菌拟核(nucleoid )的突环结构,RNA-蛋白质核心,突环由双链DNA结合碱性蛋白质组成,平均一个突环含有约40kpDNA,噬菌体T2结构,动物病毒切面模式图,被膜(脂蛋白、碳水化合物),衣壳(蛋白质),核酸,突起(糖蛋白),病毒粒,沉降系数 (sedimentation coefficient),生物大分子在单位
31、离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下,从静止状态到达极限速度所需要的时间。,数学定义式为:,沉降系数单位:由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介于110-13到20010-13秒的范围,为方便起见,把作为沉降系数的一个单位,用Svedberg单位,用即S表示。,离心机结构示意图,转头,转头腔,沉降样品,驱动马达,真空,冷冻,问答题,1、某DNA样品含腺嘌呤15.1%(按摩尔碱基计),计算其余碱基的百分含量。 2、DNA双螺旋结构是什么时候,由谁提出来的?试述其结构模型。 3、DNA双螺旋结构有些什么基本特点?这些特点能解释哪些最重要的生命现象? 4、tRNA的结构有何特点?有何功能? 5、DNA和RNA的结构有何异同? 6、简述核酸研究在生命科学发展中的重大意义? 6、计算(1)分子量为3105的双股DNA分子的长度;(2)这种DNA一分子占有的体积;(3)这种DNA一分子占有的螺旋圈数。(一个互补的脱氧核苷酸残基对的平均分子量为618) 名词解释 变性和复姓 分子杂交 增色效应和减色效应 回文结构 Tm cAMP Chargaff定律,核酸作业,1、教材P168第4题 2、教材P168第9题 3、通过查阅资料简述RNA功能及研究进展。,
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