生物化学03.ppt
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1、第三章 酶,Enzyme,第一节 酶的概念及特点,一、 酶的概念,生物体内的反应是在很温和的条件(如温和的温度、接近中性的pH)下进行的,而同样的反应若在非生物条件下进行,则需要高温、高压、强酸、强碱等剧烈的条件。,酶的概念酶是由生物细胞产生的以蛋白质为主要成分的生物催化剂。,酶催化作用并不局限于活细胞内,在许多情况下,细胞内产生的酶需分泌到细胞外或转移到其它组织器官中发挥作用,如胰蛋白酶、脂酶、淀粉酶等水解酶。把由细胞内产生并在细胞内发挥作用的酶称为胞内酶,而将细胞内产生后分泌细胞外起作用的酶叫胞外酶。,一、 酶的概念,在本章节中把酶所催化的反应称作酶促反应,发生化学反应前的物质称底物(su
2、bstrate),而反应后生成的物质称产物(product)。,一、 酶的概念,1. 酶具有共同于一般催化剂的特征,用量少; 只能催化热力学上允许的反应; 不改变反应的平衡点,而只能缩短时间。催化机理都是降低反应所需的活化能。,二、 酶的特性,一般催化剂 反应活化能,反应总能量变化,酶促反应活化能,非催化反应活化能,初 态,终 态,能 量 改 变,活 化 过 程,酶促反应降低活化能,过渡态,酶促反应的速度比非酶促反应通常要快 1051017 倍,如此高的催化效率使生物体内含量甚微的酶能催化大量的物质转化。,2. 酶不共同于一般催化剂的特征,催化效率极高,二、 酶的特性,用简单的实验证明酶的催化
3、效率:,铁屑 肝糜 肝糜(煮),1000,109,二、 酶的特性,2. 酶不共同于一般催化剂的特征,铂:催化许多反应,包括有机反应 H+:淀粉、脂肪、蛋白质、蔗糖等 酶:只作用于结构近似的分子,甚至 只催化一种化合物。,专一性很强,二、 酶的特性,2. 酶不共同于一般催化剂的特征,酶对环境条件极为敏感 酶活性可以调控,二、 酶的特性,酶催化的专一性(specificity):是指酶对它所催化的反应及其底物具有的严格的选择性。通常一种酶只能催化一种或一类化学反应。,1. 绝对专业性除一种底物外,酶都不能催化其它反应的特性,三、酶的专一性及其类型,2 相对专一性酶能催化在结构上类似的一系列化合物反
4、应特怔。,A 基团专一性(group specificity)在催化A-B化合物中,酶对其中的一个基团具有高度甚至是绝对专一性,而对另一个基团则具有相对专一性的特性。,三、酶的专一性及其类型,2 相对专一性酶能催化在结构上类似的一系列化合物反应特怔。,B 键专一性(bond specificity)在催化A-B化合物中,酶对A,B基团的结构要求不严,而要求有一定的化学键便能进行催化反应特性。,三、酶的专一性及其类型,C 立体专一性(stereo specificity)一种酶只能对一种立体异构体起催化作用,对其对映体则全无作用的特性。a.立体异构专一性:,三、酶的专一性及其类型,C 立体专一性
5、(stereo specificity)一种酶只能对一种立体异构体起催化作用,对其对映体则全无作用的特性。B.几何异构专一性 :,三、酶的专一性及其类型,Summry,三、酶的专一性及其类型,迄今为止所发现的4000多种酶中,现已有2500余种酶被鉴定出来,用于生产实践的酶有近200种,其中半数用于临床。,1. 习惯命名法,1961年以前,人们根据酶作用的底物名称、反应、性质及酶来源,对该酶冠名。,四、酶的命名,如 己糖激酶、蛋白酶、脲酶,底物名 + “酶”,1. 习惯命名法,如 己糖激酶、乳酸脱氢酶、DNA聚合酶,反应类型 + “酶”,1. 习惯命名法,如 胃蛋白酶,酶的来源,1. 习惯命名
6、法,这种命名法缺乏科学系统性,易产生“一酶多名”或“一名多酶”问题。如分解淀粉的酶,若按这种命名法则有三种名称,如淀粉酶、淀粉水解酶和细菌淀粉酶。 对于淀粉酶来说,强调的是底物;对淀粉水解酶来说,既强调底物又指出酶催化反应的性质;而细菌淀粉酶强调的是酶的来源和作用的对象。,问题,1. 习惯命名法,该命名法规定,每种酶的名称应明确标明底物及所催化反应的特征,即酶的名称应包含两部分:前面为底物,后面为所催化反应的名称。,2. 国际系统命名法,若前面底物有两个,则两个底物都写上,并在两个底物之间用“:”分开,若底物之一是水,则可略去。,2. 国际系统命名法,酶的国际习惯用名和系统命名的应用实例,国际
7、酶学委员会规定,每个酶都有唯一的特定标码,其书写方式是:,2. 国际系统命名法,乙醇脱氢酶的编码是: EC1.1.1.1 第一个“1” 第1大类,即氧化还原酶类; 第二个“1” 第1亚类,供氢体为CHOH; 第三个“1” 第1亚亚类,受氢体为NAD+; 第四个“1” 在亚亚类中的顺序号。,乳酸脱氢酶的编码是: EC1.1.1.27,2. 国际系统命名法,国际系统命名法看起来科学而严谨,但使用起来不太方便.,2. 国际系统命名法,国际酶学委员会建议: 每个酶都给予 2 个名称,五. 酶的分类,国际酶学委员会(Enzyme Commission, EC)将所有的酶按它们所催化的反应的性质分为六大类
8、。,酯酶、蛋白酶、淀粉酶,水解酶类 (hydrolase),3,谷丙转氨酶、已糖激酶,转移酶类 (transferase),2,脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、加氧酶,氧化还原酶类(oxidoreductase),1,举 例,催化反应的性质,酶的类型,分类 序号,五. 酶的分类,国际酶学委员会(Enzyme Commission, EC)将所有的酶按它们所催化的反应的性质分为六大类。,羧化酶、氨酰-tRNA合成酶、天冬酰胺合成酶,合成酶类(连接酶类)(ligase),6,差向异构酶、顺反异构酶、酮醛异构酶,异构酶类 (isomerase),5,醛缩酶、水合酶、脱氨酶、脱羧酶,裂解酶类 (lyase
9、),4,举 例,催化反应的性质,酶的类型,分类 序号,氧化-还原酶催化氧化-还原反应,催化氢的转移或电子传递。 主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。 如,乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,1、氧化-还原酶 Oxidoreductase,(1)脱氢酶类:催化直接从底物上脱氢的反应,(2)氧化酶类,催化底物脱氢,氧化生成H2O2:,催化底物脱氢,氧化生成H2O:,(3)过氧化物酶,(4)加氧酶(双加氧酶和单加氧酶),转移酶催化基团转移反应,即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。 根据X分类:转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、
10、含氮基、含磷基和含硫基的酶。 例如, 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,2、转移酶 Transferase,水解酶催化底物的加水分解反应。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如,脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应:,3、水解酶 hydrolase,裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如, 延胡索酸水合酶催化的反应。,4、裂解酶 Lyase,异构酶催化各种同分异构体的相互转化,即底物分子内基团或原子的重排过程。 例如,6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应,5、异构酶 Isomerase,合成酶,又称为连接酶,能够催化C
11、-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。 例如,丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,6、合成酶 Ligase or Synthetase,六.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶,称为细胞外酶。这类酶大部分属于水解酶。 在细胞内合成后并不分泌到细胞外,而在细胞内起催化作用,称为细胞内酶,该类酶在细胞内往往与细胞器结合,不仅有一定的区域性,而且催化的反应具有一定顺序性。,A. 了解所分离酶在细胞中分布,B. 材料的获取,在提取某一酶时,首先应当根据需要,选择含此酶最丰富的材料。由于从动物内脏或植物
12、果实中提取酶制剂受到原料限制,成本又很大,因此,目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。,六.酶的分离与提取,C. 酶分离纯化的主要步骤,1.主要步骤为:抽提、纯化、结晶 抽提:破碎细胞,动植物组织一般可用组织捣碎器;或者加石英砂研磨,将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解 ;对细菌,常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。 大多数酶一般都用缓冲液进行抽提,缓冲液的类型决定于酶的种类和理化特性,抽提液pH最好远离等电点 。,六.酶的分离与提取,C. 酶分离纯化的主要步骤,1.主要步骤:抽提、纯化、结晶 浓缩:抽提液或发酵液中酶浓度往往很低,必须浓缩富集。常用的浓缩方法有:加中性盐或
13、冷乙醇沉淀后再溶解,胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。 纯化:纯化过程就是去除杂质的过程。原则:一方面是要提高酶的纯度,另一方面却也使酶的总量不可避免有所损失。,六.酶的分离与提取,C. 酶分离纯化的主要步骤,1. 主要步骤为:抽提、纯化、结晶 结晶:浓缩液经过各种方法的纯化,可得到较纯的结晶产品。,六.酶的分离与提取,C. 酶分离纯化的主要步骤,2. 选择分离纯化方法 a.盐析法(如硫酸胺) b.有机溶剂沉淀法 c.层析纯化法(葡聚糖凝胶、离子交换层析) d.等电点法 e.吸附分离法,六.酶的分离与提取,酶活力:是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢,即酶催化
14、的反应速度越快,酶活力越高,反之则表示该酶活力低。,七.酶活力及其测定,酶的定量并非对其蛋白质进行定量,而是对它的催化能力进行定量。,所以,酶的定量就是测定酶的活力,也即测定酶促反应的速度。,1. 酶活力概念,七.酶活力及其测定,如何测定酶活力?,以产物浓度对反应时间作图,可得到酶促反应速度曲线,注意:初速度的测定是关键,为什么?,七.酶活力及其测定,可见,反应速度只在最初一段时间内保持恒定,随着时间的延长,反应速度逐渐下降,原 因 底物浓度的降低、产物的增加造成的逆反应的加快 产物的抑制作用 酶本身逐渐失活,七.酶活力及其测定,常用的酶活力单位有三种:,A. 国际单位 (IU),这种单位是由
15、国际酶学委员会规定的。,在标准条件(25、最适pH、最适底物浓度)下,酶每分钟催化 1 mmol 底物转化,这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为1个国际单位 (IU)。,2. 酶活力与单位,七.酶活力及其测定,B. Katal,是由国际酶学委员会于1972年规定的一种新单位,在最适条件下,酶每秒钟催化1 mol 底物转化,这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为 1个Kat 。,1 Kat = 60106 IU,2. 酶活力与单位,七.酶活力及其测定,C. 自定义的活力单位,这种单位简单方便,省去了许多计算;但只能进行酶活力的相对比较。,酶习惯上或测定时使用的反应速度的单位定义为酶的活力单
16、位。 有的甚至直接用测得的物理量,如单位时间内消光值的变化 (DA/t) 表示酶活力单位。,七.酶活力及其测定,指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数,比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大,表示酶越纯,比活力 ,酶活力单位数(U),酶蛋白质量(mg),3. 酶的比活力,七.酶活力及其测定,纯化倍数 = 后续每次比活力/第一次比活力,产率(回收率) =后续每次总活力/第一次总活力100%,4. 酶的纯度,七.酶活力及其测定,1. 某酶在一定条件下,5 min内使30 mmol底物转变为产物,问该酶的活力(IU)是多少?,2. 从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质,总
17、活力为360单位。经过一系列纯化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白),总活力为288单位。请问回收率是多少?,4. 酶的纯度,七.酶活力及其测定,不同样品同一酸制剂的总活力、总蛋白、比活力比较,4. 酶的纯度,七.酶活力及其测定,八、酶与疾病的发生: 酶的数量、结构、位置及其调节改变,酶与疾病的诊断:血清酶活性测定,第二节 酶动力学及影响酶反应速度的因素,一.底物浓度的影响,(一) 酶反应速度与底物浓度的关系曲线,一.底物浓度的影响,对于简单的酶反应,当酶浓度和其他条件恒定时:,Vmax,零级反应,一级反应,混合级反应,该曲线可以用米氏方程 来描述,一.底物浓度的影响,一.底物浓度的
18、影响,dp/dtkES:一级反应:反应速度只与反应物浓度的一次方成正比的反应。,dp/dtkE:零级反应,(二) 米氏方程,为了要解释这一现象,Michaelis & Menten 提出了中间络合物学说。,1. 米氏方程的推导,该学说必须两个条件: (1)符合质量作用定律:化学反应速率与反 应物的有效质量成正比 (2)形成的中间产物决定整个反应的速度,一.底物浓度的影响,Michaelis & Menten 提出了中间络合物学说。,(二) 米氏方程,1. 米氏方程的推导,一.底物浓度的影响,对于单底物、单产物反应,其反应过程需经过中间复合物ES,即,Michaelis-Menten的三个假设:
19、 (1)推导的v为反应初速度,(二) 米氏方程,1. 米氏方程的推导,一.底物浓度的影响,产物的生成量很少 k4 的反应忽略不计。即,(二) 米氏方程,1. 米氏方程的推导,一.底物浓度的影响,E酶总量;Et反应后t时的酶量; ES中间产物浓度,Et E-ES,(二) 米氏方程,1. 米氏方程的推导,一.底物浓度的影响,刚反应时,若形成的速度为v,则 v1k1 EtS k1(E)-(ES)S (1),ES消失速度: v2 k2ES; v3 k3ES v23 k2 ES k3ES (k2 k3)ES (2),(二) 米氏方程,1. 米氏方程的推导,一.底物浓度的影响,Michaelis-Ment
20、en的三个假设:,(2)反应体系处于稳态,(二) 米氏方程,1. 米氏方程的推导,一.底物浓度的影响,即ES不变 ES的生成量 = ES的分解量。即 v1 =v23 k1(E)-(ES)S = ES (k2 k3) (E)-(ES)S/ ES = (k2 k3)/ k1 (3) 设 Km=(k2+k3)/k1 将(3)重排得 ES =ES/(Km S) (4),(二) 米氏方程,1. 米氏方程的推导,一.底物浓度的影响,Michaelis-Menten 的三个假设:,E =ES,Vmax = K3ES,即K3 = Vmax/ E (5) 同时,v = K3ES, K3 = vt/ ES (6)
21、 (5) + (6) ES =vt E /Vmax (7) (7)代入(4)得 vt E /V = ES/(Km S),(3)S E,(二) 米氏方程,1. 米氏方程的推导,一.底物浓度的影响,(二) 米氏方程,1. 米氏方程的推导,一.底物浓度的影响,Km 米氏常数 由于 Km= (k2+k3)/k1 , 为复合常数。 Km是酶的特征常数,经常表示酶与底物的亲和力。 Km值越大,亲和力越小。,(二) 米氏方程,1. 米氏方程中常数的意义,一.底物浓度的影响,Km的值是当反应速度为最大反应速度的一半时所对应的底物浓度。 所以Km的单位为浓度单位,Km = S,(二) 米氏方程,1. 米氏方程中
22、常数的意义,一.底物浓度的影响,(二) 米氏方程,1. 米氏方程中常数的意义,一.底物浓度的影响,所以采用双倒数作图法:即 1/v - 1/S 作图,v-S作图法: Vmax难以测定,不能从vV/2处求得,从而导致Km也难确定。,(二) 米氏方程,3. 米氏方程中常数的测定,一.底物浓度的影响,(二) 米氏方程,3. 米氏方程中常数的测定,一.底物浓度的影响,二.酶浓度对酶反应速度的影响,在一般的酶促反应中,常常SE,酶反应速度达到最大反应速度。 当SE,由于Vmax=kE0,反应速度与酶浓度成正比。,酶浓度曲线,三. pH对酶反应速度的影响,pH对酶反应速度的影响较大。其原因有:,每种酶只能
23、在一定的pH范围内表现出它的活性,且在某一pH值范围内活性最高,其两侧活性都下降。 酶促反应具有一最适pH。,反应速度和pH的关系见下图:,酶的最适pH一般在7左右。也有很多例外,如胃蛋白酶的最适pH只有1.5,木瓜蛋白酶(5.6) ,胰蛋白酶(7.8)。 酶的最适pH并非酶的特征性常数,它与底物的种类、浓度等因素有关。,三. pH对酶反应速度的影响,温度对酶反应速度的影响具有双重性:,四. 温度对酶反应速度的影响,因此,在这双重因素的综合作用下,酶促反应具有一最适温度。,四. 温度对酶反应速度的影响,不同酶的最适温度也不一样。动物酶的最适温度一般在3540,植物酶为4050。 酶的最适温度并
24、非酶的特征性常数,它与底物、作用时间等因素有关。,五. 激活剂对酶反应速度的影响,激活剂:能提高酶活性的物质。,无机离子: 主要是金属离子,它们有的本身就是酶的辅助因子,有的是酶的辅助因子的必要成分。 如: 激酶需要Mg2+激活 唾液淀粉酶需要Cl-激活,主要的激活剂有:,五. 激活剂对酶反应速度的影响,有机小分子: 一些还原剂,如抗坏血酸、半胱氨酸,使含-SH的酶处于还原态 金属螯合剂,如EDTA(乙二胺四乙酸),可络合一些重金属杂质,解除它们对酶的抑制,从而使酶活升高。,抑制作用:有些物质与酶结合后,引起酶的活性中心或必需基团的化学性质发生改变,从而使酶活力降低或丧失。,六. 抑制剂对酶反
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