生物化学第四章蛋白质的共价结构.ppt
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1、2005-12-14,上海大学生命科学学院,第四章 蛋白质的共价结构,一、蛋白质通论,二、肽,三、蛋白质一级结构的测定,四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能,五、肽与蛋白质的人工合成,2005-12-14,上海大学生命科学学院,一、蛋白质通论,蛋白质(Protein)是生物体的基本组成成份。在人体内蛋白质的含量很多,约占人体固体成分的45%,它的分布很广,几乎所有的器官组织都含蛋白质,并且它又与所有的生命活动密切联系。,机体新陈代谢过程中的一系列化学反应几乎都依赖于生物催化剂酶的作用,而酶的本质就是蛋白质;调节物质代谢的激素有许多也是蛋白质或它的衍生物;其它诸如肌肉的收缩,血液的凝固,免疫功能,组
2、织修复以及生长、繁殖等主要功能无一不与蛋白质相关。近代分子生物学的研究表明,蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性、神经冲动的发生和传导以及高等动物的记忆等方面都起着重要的作用。,2005-12-14,上海大学生命科学学院,(一)蛋白质的化学组成和分类,单纯蛋白质的元素组成为C 5055%、H 6%7%、O 19%24%、N 13%19%,除此之外还有S 04%。有的蛋白质含有P、I。少数含Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo等金属元素。,各种蛋白质的含氮量很接近,平均为16%。由于体内组织的主要含氮物是蛋白质,因此,只要测定生物样品中的氮含量,就可以按下式推算出蛋白质大致含量:,蛋白质含量蛋白
3、氮6.25 (凯氏(Kjedahl)定氮法的计算基础),2005-12-14,上海大学生命科学学院,单纯蛋白质(simple protein):仅由氨基酸组成,不含其它化学成分。 缀合蛋白质(conjugated protein):除含有氨基酸外的各种化学成分作为其结构的一部分。非蛋白质部分称为辅基(prosthetic group)或配体(ligand)。,单纯蛋白质 (按溶解度分类),清蛋白 球蛋白 谷蛋白 谷醇溶蛋白 组蛋白 鱼精蛋白 硬蛋白,缀合蛋白质 (按非氨基酸 成分分类),糖蛋白 脂蛋白 核蛋白 磷蛋白 金属蛋白 血红素蛋白 黄素蛋白,组成,2005-12-14,上海大学生命科学
4、学院,单纯蛋白质分类,2005-12-14,上海大学生命科学学院,结合蛋白质分类,2005-12-14,上海大学生命科学学院,蛋白质 (按生物学功能分类),酶 调节蛋白 转运蛋白 贮存蛋白 收缩和游动蛋白 结构蛋白 支架蛋白 保护和开发蛋白 异常蛋白,2005-12-14,上海大学生命科学学院,(二)蛋白质的形状和大小,形状,纤维状 球状 膜蛋白,球状蛋白质globular protein 分子对称性佳,外形接近球形或椭圆形,溶解性较好,能形成结晶,大多数蛋白质属于这一类。 Eg.血红蛋白、血清球蛋白。 纤维状蛋白质fibrous protein 对称性差,分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性
5、纤维状蛋白质肌球蛋白。和不溶性纤维状蛋白质胶原、弹性蛋白 膜蛋白质membrane protein细胞的各种膜系统结合而存在,与膜内的非极性相相互作用,疏水侧链伸向外侧,亲水氨基酸残基较胞质少。,2005-12-14,上海大学生命科学学院,分子大小,蛋白质的相对分子量从大约60001106或更大一些。,单体蛋白质(monomeric protein):仅由一条多肽链组成。其相对分子量除以110估计氨基酸残基的数目。 寡聚蛋白质(oligomeric protein):由两条或多条多肽链组成。每条多肽链称为亚基(subunit)。 多酶体系,2005-12-14,上海大学生命科学学院,蛋白质分子
6、量的上下限是人为规定的,因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。 有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。,2005-12-14,上海大学生命科学学院,(三)蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次,一级结构(primary structure):多肽链的氨基酸序列。 二级结构(secondary structure):多肽链中主链原子的局部空间排布即构象,不涉及侧链部分的构象。 三级结构(tertiary structure):蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三维空间结构。 四级结构(quarternary structure):具有二条或二条以上独立三级
7、结构的多肽链组成的蛋白质,其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。,2005-12-14,上海大学生命科学学院,2005-12-14,上海大学生命科学学院,2005-12-14,上海大学生命科学学院,四、蛋白质功能的多样性,蛋白质的序列异构现象是蛋白质生物功能多样性和物种特异性的结构基础。,蛋白质的生物学功能: 1.催化;2.调节;3.转运;4.贮存;5.运动;6.结构成分; 7.支架作用;8.防御与进攻;9.异常功能;,蛋白质(protein)是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子,并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此,研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。
8、生物体最主要的特征是生命活动,而蛋白质是生命活动的体现者,具有以下主要功能:,2005-12-14,上海大学生命科学学院,二、肽,肽是氨基酸的线性聚合物,常称多肽链(peptide chain)。蛋白质是由一条或多条具有确定的氨基酸序列的多肽链构成的大分子。,(一)肽和肽键的结构,蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键。,2005-12-14,上海大学生命科学学院,肽链写法:游离-氨基在左,游离-羧基在右,氨基酸之间用“-”表示肽键。,H2N-丝氨酸-缬氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-谷氨酰氨-COOH,Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,(S-V-Y-D-Q),2005-12-14,上海大学生命
9、科学学院,肽键,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。,由于羰基碳-氧双键的靠拢,允许存在共振结构(resonance structure),碳与氮之间的肽键有部分双键性质,由CO-NH构成的肽单元呈现相对的刚性和平面化,肽键中的4个原子和它相邻的两个-碳原子多处于同一个平面上。,多肽链可以看成由C串联起来的无数个酰胺平面组成,2005-12-14,上海大学生命科学学院,肽键,肽键中的C-N键具有部分双键性质,不能自由旋转。 在大多数情况下,以反式结构存在。,肽基的C、O和N原子间的共振相互作用,共振产生的重要结果:限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺
10、平面 产生键的平均化 肽键呈反式构型,sp2,sp2,sp2,sp3,共振杂化体,2005-12-14,上海大学生命科学学院,(二)肽的物理和化学性质,短肽的晶体是离子品格,在水溶液中以偶极离子存在。在pH0-14范围内,肽键中的亚氨基不能解离。,小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似。,肽的化学反应也和氨基酸一样,游离的氨基、羧基和R基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反反应。双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的,而为氨基酸所没有的一个颜色反应。,一般短肽的旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度的总和,但较长的肽或蛋白质的旋光度则不能这样简单相加。,2005-12-14,上海大学生命科学学院,(
11、三)天然存在的活性肽,生物体内游离存在着很多活性肽,具有各种特殊的生物学功能。,激素:脑啡肽、催产素、加压素、舒缓激肽 抗生素:短杆菌肽、多粘菌素E、放线菌素D 蕈的剧毒毒素:鹅膏蕈碱 还原型谷胱甘肽 鹅肌肽、肌肽,天然肽中含有蛋白质中不存在的-肽键、丙氨酸和D型氨基酸。,2005-12-14,上海大学生命科学学院,脑啡肽,Met-脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Leu-脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-,2005-12-14,上海大学生命科学学院,牛催产素 牛加压素,2005-12-14,上海大学生命科学学院,环状八肽,鹅膏
12、蕈属中的剧毒毒素,2005-12-14,上海大学生命科学学院,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 由细菌分泌的多肽,有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸,如鸟氨酸(Ornithine, 缩写为 Orn)。,2005-12-14,上海大学生命科学学院,三、蛋白质一级结构的测定,蛋白质的一级结构指多肽链中的氨基酸序列。,(一)蛋白质测序的策略,(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。 (2)拆分蛋白质分子的多肽链。 (3)测定多肽链的氨基酸组成。 (4)分析多肽链的N末端和C末端残基。 (5)
13、断裂多肽链内的二硫键。 (6)多肽链断裂成肽段。 (7)测定各个肽段的氨基酸顺序。 (8)确定肽段在多肽链中的次序。 (9)确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质顺序测定基本方法路线,2005-12-14,上海大学生命科学学院,2005-12-14,上海大学生命科学学院,(二)N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定,1.N-末端分析,(1)DNFB法; (2)DNS法 (3)PITC法 (4)氨肽酶法,2.C-末端分析,(1)肼解法; (2)还原法 (3)羧肽酶法,2005-12-14,上海大学生命科学学院,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下,能够与肽链N-端的游离氨基作用,生成二硝基苯
14、衍生物(DNP)。 在酸性条件下水解,得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,N 末端基氨基酸测定,二硝基氟苯(DNFB)法,2005-12-14,上海大学生命科学学院,在碱性条件下,丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)可以与N-端氨基酸的游离氨基作用,得到丹磺酰氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质,检测灵敏度可以达到110-9mol。,N 末端基氨基酸测定,丹磺酰氯法,2005-12-14,上海大学生命科学学院,氨肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量,按
15、反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线,从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶,水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,N 末端基氨基酸测定,氨肽酶(amino peptidases)法,2005-12-14,上海大学生命科学学院,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热,C-端氨基酸即从肽链上解离出来,其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,C 末端基氨基酸测定,肼解法,2005-12-14,上海大学生命科学学院,此法是多肽链C-末端氨基酸分析法。 多肽与LiBH4在无水条件下加热,C-端氨基酸被还
16、原为醇即从肽链上解离出来,其余的氨基酸则不变。醇很容易与其余氨基酸分离。,C 末端基氨基酸测定,LiBH4法,2005-12-14,上海大学生命科学学院,羧肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量,从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种:A,B,C和Y;A和B来自胰脏;C来自柑桔叶;Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基;B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,C 末端基氨基酸测定,羧肽酶(carboxypeptidase)法,(三)二硫桥的断裂,断
17、裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。,2005-12-14,上海大学生命科学学院,S,S,S,S,S,S,胰岛素,HO-CH2-CH2-SH,SH,SH,SH,SH,SH,SH,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,ICH2COOH,2005-12-14,上海大学生命科学学院,作用:这些反应可用于巯基的保护。,巯基(-SH)的保护,2005-12-14,上海大学生命科学学院,还可用碘乙酸ICH2COO- 保护,在多肽链中引入负电荷。亦可用碘乙酰胺ICH2CONH2 保护。 如用乙撑亚胺保护巯基,生成氨乙基半胱
18、氨酸AECys,在肽链中引入胰蛋白酶的酶切位点。,巯基(-SH)的保护,2005-12-14,上海大学生命科学学院,(四)氨基酸组成的分析,用于蛋白的氨基酸组成测定的水解方法主要是酸水解,同时辅以碱水解。,氨基酸分析仪图谱,2005-12-14,上海大学生命科学学院,酸水解,常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解,反应时间约20小时。 此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏; 含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解;门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。,2005-12-14,上海大学生命科学学院,碱水解,一般
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- 生物化学 第四 蛋白质 共价 结构
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