高效液相色谱P关PT课件.ppt
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1、,High Performance Liquid Chromatography (HPLC),高效液相色谱技术与应用,主要内容,酸性和碱性样品 酸碱平衡与反相保留 缓冲液的选择 pKa与化合物结构的关系 离子样品反相分离的优化 选择性的控制 离子对色谱 保留机制 初始实验 控制保留值范围和选择性 离子交换色谱 离子交换色谱 保留机制 方法建立 硅胶柱,酸性样品和碱性样品,为方便讨论,我们定义“离子溶质”为在通常pH范围内含有一个或一个以上酸性或碱性官能团的有机分子。 在HPLC分离条件下,离子电荷随pH发生变化的化合物简单地称作酸或碱。 在反相色谱(RPC)中, 疏水化合物样品的保留值较大。当
2、某种酸(HA)或碱(B)发生解离,其疏水性将会大大减弱。因此在RPC中的保留值k可能下降1020倍。,几乎所有与pH相关的保留值变化均发生于pKa值1.5单位的pH值范围内,缓冲液的选择,最好先调节缓冲剂的pH,再加入有机溶剂。 选择具体缓冲剂时,应切记的几种因素: 缓冲容量 UV吸收度 其它性质:溶解度、稳定性、与样品和/或色谱柱的相互作用、挥发性、对HPLC系统的腐蚀等,缓冲容量,缓冲容量由pH、缓冲剂pKa及其浓度决定 与样品化合物的情况类似,缓冲剂发生解离的pH范围为pKa1.5。只有在此pH范围内缓冲剂才能有效地控制pH值。 1050mM浓度的缓冲剂对RPC分离一般足够,pKa与化合
3、物结构的关系,若不知样品组分的pKa值,可以通过样品的分子结构估计出。,较好的流动相pH,样品中最常见的酸或碱取代基-NH2、-N(CH3)2等、碱性杂环和羧酸(-COOH)基团。 与pH有关的保留值变化最可能发生于pH36的范围内,不包括烷基胺化合物。 无论已知还是未知样品,开始RPC方法建立时最好选用pH微小改变不影响分离的流动相(pH3),哪种HPLC法对离子样品最合适,RPC具有简单、应用范围广和较好的柱性能等特点,通常是首先的分离模式。 若分离不够理想,还可考虑在流动相中加入离子对试剂。 在离子对试剂浓度由零变至最大值时,会有RPCIPC保留值的连续变化。所以起初的RPC实验有助于后
4、面IPC分离条件的优化选择。 对特殊分离目的,可以考虑从离子对或离子交换色谱开始。,优化离子样品的相分离,离子样品反相分离的方法建立与中性样品有些相似,主要差异为需用: 经pH缓冲的流动相 硅羟基效应最小的反相柱 当首次开始HPLC方法建立时,并不知道合适的分离是否需要改变pH,所以初始实验的流动相pH3最好。 下一步通过调节流动相强度(%B),以使样品具有合适的保留值范围0.5k20。 离子样品不大可能被强保留,很可能获得较宽的k值范围。因此方法建立的最佳方案是初始运行用梯度洗脱。 梯度选用宽范围(如5%100%B),必须注意避免高%B时析出缓冲盐 调整峰间距,即尽量扩大样品的分离度或降价保
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