高效液相色谱法及超临界流体色谱法.ppt
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1、现代分析技术,第十章,第十章 高效液相色谱法及超临界流体色谱法,10.1 概述 10.2 高效液相色谱法的基本原理 10.3 高效液相色谱法的类型 10.4 高效液相色谱仪 10.5 超临界流体色谱法 10.6 实验技术,2,10.1 概述,HPLC high velocity, high resolution and high sensitivity High-Performance Liquid Chromatography High-Pressure Liquid Chromatography High-Price Liquid Chromatography,3,4,5,10.2 HPL
2、C的基本原理,GC的基本理论、基本概念适用于HPLC。液相色谱的van Deemter方程,6,板高H越小,分离效率越高。可以从色谱柱、流动相、及流速等方面 综合考虑,,提高HPLC的柱效的措施,采用颗粒小而均匀的填料,填充均匀; 采用表面多孔的填料,减小填料的孔隙深度; 流动相采用小分子溶剂,减小粘度( H2O、ACN、MeOH) ; 适当提高柱温,增大Dm; 采用一定的流动相流速u(一般1 mL/min),7,柱外效应:柱前峰展宽柱后峰展宽 柱前峰展宽进样及进样器到色谱柱连接管引起 柱前后展宽检测器流通池和连接管引起,10.3 HPLC的类型 I 液液分配色谱法 Liquid Liquid
3、 Partition Chromatography, LLPC,固定相与流动相均为液体(互不相溶); 基本原理:组分在固定相和流动相上的不同分配而实现分离; 固定相:早期涂渍固定液,容易流失,现较少采用;化学键合固定相:将 各种不同基团通过化学反应键合到硅胶(担体)表面的游离羟基上。,8,(1)寿命长,固定液不易流失,柱稳定性高; (2)传质快,表面均一,无深凹陷,比一般液体固定相传质快; (4)选择性好,可键合不同基团改变其选择性; (5)耐受各种溶剂,有利于梯度洗脱;,流动相类别,流动相按极性分: 极性(乙腈、甲醇、水); 弱极性(氯仿、乙酸乙酯); 非极性(己烷);,9,正相色谱法 反向
4、色谱法,采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性,以改进分离或调整出峰时间。,II 液固吸附色谱法 Liquid Solid Absorption Chromatography, LSAC,10,固定相:固体吸附剂(硅胶) 基本原理:根据组分在固定相上的吸附作用的不同进行分离; 样品分子(X)被流动相带入柱内,与流动相分子(S)在吸附剂的表面发生竞争性的吸附作用.,吸附平衡常数 K 越大,保留值越大。 LASC中,流动相:烷烃为底剂的二元或多元溶剂, 己烷乙酸乙酯;己烷氯仿,III 离子交换色谱法 Ion Exchange Chromatography, IEC,K
5、 越大,离子交换能力越强,固定相对被分析离子的保留越强; 分析对象:离子(各种无机阴阳离子):SO42+、NO3、Cl、Na、Mg等 有机酸碱、氨基酸,11,固定相:离子交换树脂 (聚苯乙烯和二乙烯基的交联聚合物,硅胶键合离子交换剂) 流动相:含有反离子的水溶液 (柠檬酸根离子、CO3、F) 基本原理:样品中离子与离子交换树脂的交换能力的不同进行分离;,12,13,IV 离子对色谱法 Ion Pair Chromatography, IPC,固定相:C18/C8上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反 的离子对试剂 流动相:有机溶剂 (甲醇/乙腈水)加入离子对试剂 离子对试剂: 烷基铵类:(C
6、4H9)4N+OH- 、C16H33(CH3)3 N+OH- (分析X) 烷基磺酸类 :己烷磺酸钠C6H13SO3Na (分析X) 基本原理:根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离。,14,生成的离子对与固定相的亲和力越大,保留越强,出峰越后。 分析对象:有机酸、有机碱等,Column: IonPac NS1、NG1 Eluent : 2 mM TBAOH, 24%48% ACN in 10 min Flow rate: 1.0 mL/min Detection: Conductivity (suppressor type) Regenerator:10 mN H2SO4 1. Meth
7、anesulfonic acid 5.0 g/mL (ppm) 2. 1-Propanesulfonic acid 8.6 3. 1-Butanesulfonic acid 8.7 4. 1-Hexanesulfonic acid 8.8 5. 1-Heptanesulfonic acid 8.9 6. 1-Octanesulfonic acid 8.9 7. 1-Decanesulfonic acid 9.1,0,Retention time (min),12,16,8,S,0.0,4,8.0,反相离子对色谱分离有机酸,V 离子色谱法 Ion Chromatography, IC,固定相:离
8、子交换树脂 流动相:电解质溶液(高电导) 分离原理:同IEC,离子交换后的洗脱液进入抑制柱后进行电导检测 特点:抑制柱将样品离子转变成相应的酸、碱增加电导,将洗脱液变 成低电导成分降低背景干扰。,16,分析对象:无机、有机阴阳离子、糖类、氨基酸等,抑制器的作用,废液,17,抑制器,安装在电导池之前 提高待测离子的电导率: Na+, Cl- H+, Cl- 提高灵敏度 降低背景电导 (淋洗液) : Na+, HCO3- H2CO3 减少噪音,Na+, OH- H2O,18,抑制器的工作原理 (阴离子),X-: 样品中的阴离子 Y+: 样品中的阳离子,H2O,H2O,OH-,H2O Na+ Y+
9、X- Na+ CO32- (样品, 淋洗液),电极 (),电极 (),纯水或来自检 测器的流体,阳离子交换膜,阳离子交换膜,19,H2O,H2O,废液 / 气体,废液,H2O SO42- Y+ X- H+ MSA- (样品e, 淋洗液),H+,抑制器的工作原理 (阳离子),X-: 样品中的阴离子 Y+: 样品中的阳离子,电极 (),电极 (),阴离子交换膜,阴离子交换膜,纯水或来自检测器的液体,20,20,VI 空间排阻色谱法 Size Exclusion Chromatography, SEC,22,动画,特点: 体积大的分子完全被排阻洗脱下来 体积小的分子最后的被洗脱下来 分析对象: 高聚
10、物,生物大分子(蛋白、核酸),VII 亲和色谱法 Affinity Chromatography, AC,固定相:固定相表面键合特异性配基 流动相:类似LLPC(乙腈/甲醇、水等) 分离原理:根据固定相对溶质的特异性吸附而分离 分离过程:一般流动相携带试样 亲和物与配基结合 强洗脱能力的流动相 洗脱亲和物(大分子),23,分离对象: 酶与基质(或抑制剂) 抗原与抗体 激素与受体 外源凝集素与核酸的碱基对,10.4 高效液相色谱仪,24,仪器特点:高压、高效、高速 分离对象:生物大分子、天然产物、高分子化合物、大多数高沸点有机化合物,工作过程:,高压输液系统,核心部件:高压泵 压力范围:30 5
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