细胞培养概述2006级研.ppt
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1、细胞培养总论,刘 梅 南通大学神经再生重点实验室与神经科学系 ,一、细胞培养的基本条件,无菌/灭菌条件:净化工作室,风淋室,传递窗,高效过滤器, 洁净层流罩,生物安全柜,超净工作台,紫外灯, 电热干燥箱,滤器,高压灭菌器,抗生素 细胞生长条件:纯水蒸馏器,纯水仪,培养板,培养瓶, CO2培养箱,培养基,血清 细胞检测条件:倒置显微镜,酶标仪 ,微孔板震荡器, 高速离心机,移液器 细胞保存条件:液氮罐 实验室安全: 生物实验室安全,P1, P2, P3 实验室安全,净化工作室,细胞培养室,风淋室 风淋室是生物洁净室的理想配套设备,它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃,减少带入洁净室的灰尘量,而
2、且兼有气闸室的功能,可防止非洁净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板,吹淋板采用进口不锈钢制作,吹淋口方向可调,风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋室可以配合加热器,冬天可以加热,温度可调,一般控制温度在30-35较为适宜。,传递窗 该装置是一种洁净室的辅助设备,主要用于洁净区与洁净区,洁净区与非洁净区之间小件物品的传递,以减少洁净室的开门次数,把对洁净区的污染降低到最低程度。,高效过滤器 高效过滤器是用超细玻璃纤维纸作滤料,胶板纸作分隔板,可与铝合金框、木框及镀锌钢板框组合而成。 特点:具有低阻高效、轻质、容尘量大等特点,层高的要求,缩小净化设备静压箱体积等优点。 适用于常温常压常
3、湿条件下环境空气的净化,尤其适用于需要高效空气过滤器覆盖率高的净化厂房。,洁净层流罩,层流罩是可提供局部高洁净环境的空气净化设备。它主要由箱体、风机。初效空气过滤器、高效空气过滤器、阻尼层、灯具等组成,外壳为不锈钢或彩钢板。 洁净层流罩是将空气经风机以一定的风压通过高效空气过滤器后,由阻尼层均压,使洁净空气呈垂直层流型气流送入工作区,从而保证了工作区内达到工艺所需的高洁净度。,技术性能参数: (1)净化等级:100级(美国联邦标准209E) (2)平均风速:0.250.45m/s(可调) (3)噪音:62dB(A),超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘
4、埃颗粒,使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面,使工作台内构成无菌环境。,生物安全柜的选择,一种既能使操作造成无菌、无尘的局部空气环境,保证检验、检测不受污染,又能保证被研究的对象(如病菌、细菌等)不外溢,保护周围环境及操作人员的安全隔离设备。 该设备可广泛应用于低、中等危险度(病原体1-3,DNA重组P1-P3)的临床细菌学,病毒学、微生物学、组织培养、生物学及生命科学的研究,加工、检验部门。,II级A型生物安全柜,100 fpm 吸风量 70%气体循环使用 . 30%气体排出,既可以接管道外排,也可以不接管道直接排放在实验室,A2型生物安全柜,“全排” 100 fpm吸气量 0% 气体循
5、环利用. 100% 气体外排,适用于P3实验室,B2 型生物安全柜,紫外灯,主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒,紫外线消毒。,干热消毒(160 ,2小时),主要用于玻璃器皿消毒,电热干燥箱,滤 器,大多数培养用液,如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。,Zeiss滤器(过滤除菌):,大容量高压灭菌器,全自动手提式灭菌器,湿热灭菌装置,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,细胞培养用水装置,培养板与培养瓶,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37 ,100%湿度,5CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题: 用螺旋口瓶培养细胞时, 需将瓶盖微松,以保证通气。 保
6、持培养箱内空气干净。 定期消毒(90 ,14 h)。 箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水 以保持箱内湿度,避免培养液蒸发。,移液器,培养细胞的观察,正置显微镜,酶标仪 微孔板震荡器,高速离心机,超速离心机,液氮罐,实验室安全,层流净化细胞培养室管理规则 一级生物安全防护实验室 二级生物安全防护实验室 三级生物安全防护实验室 四级生物安全防护实验室,层流净化细胞培养室管理规则 重点实验室层流净化细胞培养室设计标准为万级,专供细胞培养、冻存以及细胞治疗用。层流净化细胞培养室的总体要求:经济、有序、高效、安全。初步制定相关制度如下:,必须取得实验室相关实验技能考试合格方可进入层流净化室; 在本室工作的
7、实验人员应严格遵守本室工作守则,外来人员在进入净化室工作之前,必须接受培训; 没有经过培训的人员不得单独进入净化室工作; 进入净化室后要保持安静,不得大声喧哗。,1.准入制度,2.安全制度 层流净化室内必须注意安全用电; 谨慎使用酒精灯,不能在有明火的情况下加、换酒精; 实验人员自觉维护室内设备的安全使用,对室内的仪器如CO2孵箱等要经常注意机器运转情况,发现问题及时检修或报告请人检修; 离开层流净化室必须断开必要的仪器电源; 对不符合层流净化室安全规定的行为主动报告主管老师。,3.卫生消毒制度 一般情况下细胞间每日消毒一次(包括缓冲间),方法为紫外线消毒(每次30分钟至1小时)一次,另外每周
8、用10乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟; 实验完毕应及时清理所用物品,注意台面整洁; 及时清洗所用隔离衣,并高压灭菌后存放于指定位置; 除实验必须的用品外,其它物品不得带入净化室; 层流净化室内所用仪器及附属设备均应在指定范围内使用,不得随意转移地点,以便他人顺利使用; 层流净化室实施值日生负责制,值班人员负责检查室内是否保持清洁整齐,督促违反规定者改正错误。,4.出入制度 层流净化细胞培养室共有两个缓冲间,进入每个缓冲间必须更换指定消毒的拖鞋; 穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行离开层流净化室; 人员流动:原则为进出净化室应按次序开、关门,只有将前面打开的门关闭后才允许打开下一个门,出入线路绝对
9、不能逆行,使缓冲间起到应有的作用。 物品流动:所有进出层流净化细胞培养室的物品均应通过传递窗进行;物品进入层流净化细胞培养室时,应先打开传递窗外侧门,将物品放入传递窗,关闭传递窗外侧门,打开紫外灯照射15分钟;人员进入层流净化细胞培养室后,关闭紫外灯,打开传递窗内侧门,取出物品;物品出室次序与以上进室次序相反,但不需紫外线照射。,二、培养细胞的生长条件,细胞的营养需要 细胞的生存环境 渗透压: 温度: 37,O2 CO2: 5%,CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.27.4 无污染 无毒,细胞培养常用器材处理方法,体外培养细胞使用的器材品种较多。离体细胞对各种毒物都
10、很敏感,所用器材的清洗、消毒处理是培养能否成功的关键之一。,清洁液的配制,一、玻璃器材(各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管 等) 浸泡(自来水)、刷洗(洗衣粉)、清洁液处理(24小时)、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干包装杀菌。一般用121磅高压蒸气灭菌20分钟。 二、塑料器材(多孔培养板、培养皿、培养瓶及吸嘴 等) 塑料器皿若反复使用:使用后,先用自来水浸泡冲洗、晾干,再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜,用自来水充分冲洗,双蒸水冲洗,晾干。采用紫外线直接照射或辐照灭菌办法。清洗时要防止产生划痕。 三、橡皮器材 选择质软、耐高温、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品) 。新购置
11、的自来水冲洗去,5%氢氧化钠煮沸15分钟,自来水冲洗,4%盐酸煮沸15分钟,自来水冲洗,单蒸水冲洗,双蒸水(或去离子水)冲洗,晾干后包装或置于铝盒内,用121高压蒸气灭菌20分钟。,四、金属器材(解剖器械,剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头等) 新的金属器材,先用纸擦去表面的油脂,再用洗衣粉煮沸,水洗,擦干后再用95%酒精纱布擦干,包装或置铝盒内于121高压蒸气灭菌20分钟。已用过的金属器材,及时用酒精棉球擦干净,灭菌。 五、其他物品 纱布、注射器的针头等; 各种人工合成培养液、缓冲液和酶 等、过滤除菌。 消毒灭菌前所用的包装材料可用牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒和
12、特制玻璃(或金属)消毒筒等,可根据器材大小、形态选用,采取局部包装或部分包装,并用线绳扎紧。,水:新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS)又称生理盐水或盐溶液,是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖配制而成,起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。 配液时注意:(1)用水;配制先后顺序;称量,要看清药品的规格、纯度、结晶水的数量等。(2)物质的纯度,常用的纯度有优级纯(特级纯),分析纯(AR)和化学纯(CD)三种。(3)物质的可溶性,避免沉淀析出。(4)物质的稳定性,如葡萄糖只能在10磅下维持1520分钟。(5)贮存液 通常
13、先配制成10倍或100倍的一系列母液,用前临时混合和稀释,过滤除菌备用。 常用的缓冲液:生理盐水、PB、PBS(注意有无钙镁离子)、 Hanks液(含有钙镁离子、葡萄糖、酚红),细胞培养用液的配制,pH调节液 (1) 碳酸氢钠液 可根据需要与使用方便配制10%以下的各种浓度。先用双蒸水溶解后,需经过滤除菌,分装小瓶中。亦可使用高压蒸气灭菌,密封,4冰箱保存。市售有5%10%浓度的安瓿封装品,使用也很方便。在调节pH过程中或超过要求值时,可用高压灭菌的10%醋酸溶液或以CO2调节。 (2) Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂。通常使用浓度为1015mm
14、ol/L。配制时,称取所需的Hepes量,用培养液溶解,用1mmol/LNaOH调节pH至7.0,过滤除菌分装小瓶中,4冰箱保存。,消化液 胰蛋白酶溶液 一种黄白色粉末,易受潮,应密封放置阴暗干燥处。它的主要作用是使细胞间的蛋白质水解,从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来。常用浓度为0.25%或0.5%胰蛋白酶。 EDTA(乙烯二胺与乙酸或Versene)溶液 EDTA是一种化学螯合剂,毒性小,对贴壁细胞有离散作用。一般使用浓度为0.02%。 称0.1g 溶解于500ml无钙镁离子磷酸缓冲液中,15磅30分钟高压灭菌,4或室温保存。 胰蛋白酶EDTA溶液 0.5%胰蛋白酶液96mL,
15、1%EDTA液4ml,无钙镁离子缓冲液100ml。,抗生素溶液 为防止细胞培养过程中发生污染,一般在培养液中加入青霉素钠盐和硫酸链霉素,其浓度分别为每毫升含100U和100g 。 配制时取青霉素1106和链霉素1106g,溶于100ml Hanks或PBS中,使其含量为青霉素1104U/ml,链霉素1104g/ml,使用时每100ml培养液中加入0.51ml。,培养基,培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液,分天然培养基和合成培养基。 天然培养基: 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)。 优点:营养成分丰富,培养效果好。 缺点:来源受限。成分复杂,影响对某些实验产物
16、的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。,合成培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量,用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基,如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点:标准化生产,组分和含量相对固定。成本低 。 缺点:缺少某些成分,不能完全满足体外细胞生长需要。,人工合成培养基只能维持细胞生存,要想使细胞生长和繁殖,还需补充一定量的天然培养基(如血清)。 血清中含有: 多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等); 多种金属离子; 激素;各种生长因子; 促贴附物质,如纤粘蛋白、冷析
17、球蛋白、胶原等; 胰酶抑制因子; 转移蛋白; 不明成分。,血 清,一般说来,含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死,但支持细胞生长一般需加10血清。 对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明,但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。 血清中不仅存在促细胞生长因子,同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子,因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域,迫切需要用无血清培养基培养细胞。,血清的作用,无血清培养基的主要研制策略:在基础培养基中补充各种必需因子,如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。
18、 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 1975年,Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株,近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。但是向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液,很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株,所需补加物也不同。 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性,减少了细胞污染,简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。 无血清培养基尚处于研究阶段,难以推广。目前,绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。,无血清培养基,血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清
19、有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等,其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活(消除补体活性):56 ,30 分钟。 血清的消毒:过滤除菌。,血清的使用,在培养液配制后,培养液内常加适量抗菌素,以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素:每毫升100单位-方便、广谱、稳定。,抗菌素的使用,基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青霉素 100单位/毫升 链霉素 100微克/毫升,完全培养基的组成,合成培养基(粉
20、) 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青霉素 100单位毫升 链霉素 100微克毫升 加三蒸水 至1000ml 过滤除菌,调节pH值至7.2 加血清(终浓度 10)。,培养基的配制,三、细胞培养的基本操作技术,体外培养细胞缺乏抗感染能力,所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室,若实验者粗心大意,技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌,每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。,消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant) 灭菌(sterilization) 防腐(antisepsis)和防腐剂 抑菌(bacterios
21、tasis)和抑菌剂(bacteriostatic) 无菌(asepsis) 无菌技术/无菌操作(antiseptic technique),Terms to remember,在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求,准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内,然后开始消毒。这可以避免开始实验后,因物品不全往返拿取而增加污染机会。,【培养前准备】,无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次(拖布专用),紫外线照射消毒30-50min,超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切
22、勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线,消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置,否则会遮挡射线降低消毒效果。操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,【操作野消毒】,原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时,可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时,因整个前臂要伸入箱内,应着长袖的清洁工作服,并于开始操作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。,【洗手和着装】,在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时,首先要点燃酒精灯。以
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