分子生物学实验十二.pps
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1、分子生物学实验,实验十二 原核蛋白质SDS-PAGE电泳技术,1.实验目的: 利用SDS-PAGE电泳检测表达蛋白,确定蛋白质的分子量。并掌握其原理与方法。 2.实验原理: 天然蛋白质在电场中泳动的迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量的大小以及分子形状等因素。1967年Shapiro等人发现,在有阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate -SDS)存在时,蛋白质的迁移率主要取决于它的分子量大小,而与其所带电荷的多少以及形态无关。,SDS能够打开蛋白质的氢键和疏水键,使蛋白质变性为松散的线状。同时大多数蛋白质能够按每个氨基酸与固定量的SDS结合,形成蛋白质SDS
2、复合物。其结果:1、SDS带有很强的负电荷,所以使SDS复合物都带有相同密度的负电荷,其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,基本掩盖了不同种类蛋白质分子原有的电荷差别;2、SDS与蛋白质结合后改变了蛋白质原有的构象,使所有蛋白质水溶液中的形状都近似长椭圆柱形。不同蛋白质SDS复合物的短轴直径都一样,约为18A,而长轴则与蛋白质分子的大小呈正比。这样SDS蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率,就不受蛋白质原有电荷及形状的影响,而取决于椭圆柱的长度,即蛋白质分子量的大小。,不同浓度的聚丙烯酰胺适用于不同范围的蛋白质分子量大小的测定。 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以人工合成的聚丙烯酰胺凝胶作为支持剂的一种电泳
3、方法。聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺简称Acr(Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺简称Bis在催化剂作用下聚合而成。TEMED称为四甲基乙二胺作为催化剂,AP过硫酸铵作为活化剂。AP活化TEMED,活化的TEMED催化丙烯酰胺结合成长链,并由甲叉双丙烯酰胺的横链连接起来,形成立体的网状结构,因此甲叉双丙烯酰胺是一种引入横链的交联剂。这样一定比例的丙烯酰胺(简称Acr)和甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在AP和TEMED催化下就能够形成一种具有多孔、多分枝而又相互连接的聚丙烯酰胺凝胶。,聚丙烯酰胺胶液灌入玻璃管中,凝固后垂直电泳称为管状电泳,灌入两块玻璃板之间的狭缝中,凝固后垂直电泳称为板状电泳。聚丙烯
4、酰胺凝胶电泳系统,可以仅有一种浓度的凝胶,一种pH值和一种缓冲液组成,称为连续系统;也可以有两种以上不同浓度的凝胶、pH值及缓冲液组成,称为不连续系统。,3.材料与仪器 诱导的细菌裂解液,制胶夹,电极架,移液器 4.试剂与配制 配制储存液:(1)30%凝胶贮液(W/V): 29.2g Acr(丙烯酰胺);0.8g Bis(甲叉双丙 烯 酰胺) 用D.D.W.溶解,定容至100毫升。过滤,4C,棕色瓶避光保存有效期为30天。 (2)10%SDS: 10gSDS溶于100mlD.D.W.,过滤,室温备用。 (3)电极缓冲液(pH8.3):3.0g Tris(三羟甲基氨基甲烷);14.4g 甘氨酸;
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- 分子生物学 实验 十二
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