细胞生物学技术2011111.ppt
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1、细胞生物学最常 用的技术,细胞生物学最常 用的技术,2011年7月15-18日北京九华山庄全国细胞生物学学术大会,组织学技术,组织制片技术 胚胎学制片技术 组织细胞化学技术 荧光组织化学及免疫化学技术 组织(细胞)培养技术 各种显微镜技术,组织学技术包括:,组织制片技术,一、组织制片方法分类:大致分类为 超活体染色制片:又称体外活体染色。 活体染色制片: 分离制片法: 涂片法、印片法 、整装片、切片法 血管注射法;整体切片法;,(一)、动物处死: 直接杀死法: 用金属器械猛击动物的后脑 部(第四脑室区)。 颈椎断裂杀死动物。 空气栓塞,组织石蜡标本的制作,麻醉致死: 麻醉剂应以不影响细胞原有形
2、态结构为宜,取材越快越好,否则组织和细胞成分构造均易发生变性。 乙醚吸入麻醉法 戊巴比妥钠或乌拉坦注射麻醉法,(二)、取材: 1. 动物的选择:必须根据教学或科研目的和 要求来确定。 2.取材方法: 取材顺序: 先腹腔:先肝脏、胆囊,其次肾脏、肾上腺, 再取胰腺、脾、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠。 后胸腔及盆腔内器官、组织, 最后取神经。,例如:肝脏: 大体检查,又无充血、脂肪肝变性,肝硬化、寄生虫、肿瘤。 然后取肝右叶或外左叶中部,作纵切或冠状切面。, 胃:分贲门、胃底、胃体和幽门,胃取材以空的为好。如有食物,应用生理盐水清洗干净,检查是否有充血、溃疡。 正常胃粘膜呈灰白色,因胃腺主要分布
3、在胃体和胃底,故取材时一般取胃底和胃体部,作纵切。 组织洗干净后放在滤纸上铺开,防止卷缩,而后投入固定液中。,贲门、食道交界处,胃底部,胃体部,幽门部,胃的取材:一般作纵切面,十二指肠: 一般取降部和水平部,(分球部、降部和水平部)为了防止肌层收缩时粘膜外翻、变性,取材中可将固定液注射进十二指肠中,两端用线结扎,投入固定液中4-6小时后,除去二端的结扎部位,做横断切面,再继续固定。,结肠:一般取横结肠,纵切,洗净,附贴在滤 纸上。,肾脏:由于组织容易出现蛋白质变性、混浊肿胀和脂变,有时则出现肾小管自溶,因此取材和固定是关键。 a.固定后再取材 : b.沿肾外缘的中部纵剖成两半,然后再做扇形切面
4、 .,固定液从动脉注 入,从静脉流出,纵剖成两半,再做扇形切面, 肺:因主要观察肺内各级支气管和肺泡的结构,故不能取边缘,应取肺小叶的中部,一般做横切面,能看到全貌(肺内小支细支、终末细支、呼吸性支、肺泡囊、肺泡)。,可观察到肺内小支、细支、终末细支、呼吸性支、肺泡囊、肺泡。,脾脏:应切断各处静脉放血,必要时可切开脾脏两端,用盐水冲洗,致脾脏呈灰白色。一般做横切面取材。,切开两端,放血,用盐水冲洗,(三)、固定(Fixation)和固定液(Fixative) 1. 固定的目的和意义 在于保持组织内细胞的形态、构造及其组成,使其与生活时原有形态和结构相似。,2. 固定的方法: 小块组织固定、局部
5、注射固定、 整体注射固定、蒸气固定,3 固定液:分单纯固定液和混合固定液。 组织固定剂很多: 最常用的有甲醛、乙醇、丙酮、重铬酸钾、苦味酸、锇酸、醋酸。,根据它们对蛋白质的作用又分为,能使蛋白质沉淀凝固的:,不能使蛋白质沉淀凝固的 :,乙醇、丙酮、苦味酸、铬酸,甲醛、重铬酸钾、锇酸、醋酸,中性甲醛:甲醛(37%-40%) 100ml 磷酸二氢钾 4g 磷酸二氢钠 6.5g 蒸馏水 900ml,最常用的固定剂,(四)、组织冲洗、脱水与透明,组织冲洗:一般必须用水冲洗,其目的,a. 停止固定液继续对组织的作用;,b.去除组织内固定液,以免影响染色;,方 法,简单冲洗,系列冲洗,水槽冲洗,酒精洗涤,
6、组织脱水:(Dehydration ) 标本经过固定和冲洗,组织中含有大量的水分,必须除去组织中的水分,这一过程为脱水。 脱水剂: 即能与水在任何条件下混合,并使组织中的水逐渐出去,由脱水剂取代组织中的水分,同时又能与透明剂混合。 种类:乙醇、乙醚、正丁醇、异丁醇、二氧氯环等。,乙醇,丙酮,正丁醇,乙醇: 即可作固定剂,又可作脱水剂,但乙醇与水混合时有较强的物理反应,高浓度的酒精对组织有较强的收缩和脆化作用,因此组织不能直接进入纯酒精中脱水,应由低高浓度,逐渐取代组织中的水分,以保证组织脱水彻底,避免组织过渡收缩和硬化。,脱水方法: 为减少组织的收缩,浓度应由低向高过渡。,50%,70%,80
7、%,90%,95%,100%,应根据组织的体积与厚度而定。时间随组织块的体积、厚度的增大而延长。 一般:11cm体积 50、70、80%各 浸泡6-8小时; 2-3mm厚 95%中 浸泡2-4小时; 纯酒精浸泡1-2小时 ;,脱水的时间(Clearing),组织透明 组织块经脱水后,需进行石蜡包埋,然后切片,但酒精不能与石蜡混合,需经一种乙醇与石蜡之间的媒介物进行透明,即透明剂。 透明剂 可取代组织中的乙醇 使组织透明,组织透明后浸入石蜡中,石蜡可取代组织中的透明剂,浸入组织中。 透明剂是石蜡的溶剂。 透明剂的种类:最常用的有二甲苯、甲苯、苯、香柏油等。,二甲苯: 最常用,易挥发,透明力强,能
8、溶于醇及醚,但不能与水混合,是石蜡的溶剂。组织在二甲苯中透明的时间不宜过长,否则易于收缩、变硬、变脆。故一般在浸入二甲苯前,应先经二甲苯与酒精混合液,以减少组织的收缩。,(五)、组织浸蜡与包埋 1. 浸蜡:组织经脱水、透明后,即进入已溶化了的石蜡中,熔化的石蜡透过组织间隙,渗透到组织中,然后包埋成组织蜡块。 石蜡分:软蜡,熔点45-54,用于浸蜡; 硬蜡,熔点56-58或60-62, 用于包埋。,软蜡 软蜡 硬蜡 包埋,软蜡48-50 软蜡54-56 硬蜡56-60 ,2.包埋:即组织经固定、脱水透明及浸蜡后,使蜡浸入组织达饱和状态,并连同熔化的蜡一块倾入一个特别的包埋框内,冷却后,便凝固成定
9、形的蜡块。,特制的包埋框,纸盒的制作,选蜡原则,夏天用溶点高的蜡(60-62),冬天用稍软的蜡即可(56-58),包埋:以硬蜡为好。,石蜡包埋的操作过程:, 组织浸蜡至第三号蜡中, 装好金属包埋框, 包埋蜡置电炉上溶化,到温度应控制在65左右。, 点燃酒精灯,准备无齿尖镊子,写好标签;, 将熔化的包埋蜡倾入金属包埋框,或纸盒中。倒满即可。, 将组织块切面朝下,放至纸盒中央,并用镊子轻微压一下,然后将标签分别放在蜡块上。,标签,切 片,铺 片,烤 片,H-E染色 1 脱蜡:二甲苯I液5-10,II液5-10。 2 脱苯:100%乙醇8-10。 3 水化:95%乙醇5,80%乙醇5。 4 苏木精染
10、5。 5 分化:用1%盐酸作用1。 6 反兰:10-15(流水)。 7 伊红:30-60(30秒为好) 8 脱水:80%乙醇一涮,95%乙醇I液一涮,95%II液一涮。100%乙醇I液7-10,II液7-10。 9 二甲苯透明:I液中7-10,II液中7-10。封片,免疫组织(细胞)化学 免疫组织化学(immunohistochemistry)又称免疫细胞化学(immunocytochemistry)是利用特异性抗原抗体反应原理,在原位观察和研究组织细胞内,有关特定的抗原或抗体的存在和分布,并进行定量的技术。由于抗原抗体的结合是高度特异的,因此免疫组织化学方法具有高度的特异性、灵敏性和精确性。
11、,免疫组织化学包括的内容,免疫细胞化学的优点,灵敏度高,特异性强,定位准确,应用广泛,组织材料的制备 免疫组织化学不仅要求保存细胞、组织内形态结构的完整性还需要保存细胞和组织内抗原的免疫性活性,因此在组织材料的制备中有一定的特殊要求。,取材 固定 脱水 浸透 包埋 切片,免疫组化的染色原理与方法 免疫组织化学染色又称免疫染色(immunostainig)根据标记的抗体的不同,可分为几种如: 1.直接法(一步法):将标记物标记在特异性抗体上(一抗),便可直接与细胞或组织内的相应抗原特异性结合而被显示;,2 间接法(二步法):将标记物标记到抗特异性抗体的抗体(二抗)上; 3 桥连法(多步法):用与
12、一抗同种动物产生的抗标记物抗体与标记物形成免疫复合物(PAP,APAAP),再通过桥抗体与一抗相连。 4 ABC法:利用生物素、抗生物素间亲和特性建立的方法。,固定剂的种类: 醛类固定剂: 10%的中性福尔马林、 4%多聚甲醛磷酸缓冲液 非醛类固定剂: 丙酮 Carnoy氏液,,一、 免疫酶组织化学染色法 (一)、酶标抗体法 1原理:酶标抗体染色分为直接法和间接法 直接法:将酶标记在第一抗体上,直接检测细胞和组织内特异性抗原。该法简便、特异性强、需时短、但敏感性低,其缺点是每一种抗原都需要用酶标记的特异性抗体,且抗体需要量大,现已不常用。(图),组织抗原,抗体,标记物,直接标记法,间接法: 所
13、用的第一抗体是细胞组织内抗原的特异性抗体,第二抗体是第一抗体的抗体,并且已用酶标记。(图)优点是一种酶标记抗体可以与多种一抗配合检测,敏感性高于直接法。第二抗体与第一抗体必须是不同种属动物制备的,因第二抗体往往是用第一种动物的IgG所制备,否则就不能检测出不同特异性抗原的存在。,第一抗体:是细胞内抗原的特异性抗体,标记酶的二抗:是一抗的抗体,抗原,间接法,2 显色反应 免疫组织化学方法最终的生成物是带有酶标记的抗原抗体复合物,再依据酶与底物作用生成不溶性的有色沉淀产物沉积在抗原反应的位置,并借此确定该抗原的性质、存在部位的含量。反应原理如下: HRP: HRP与底物过氧化氢和DAB(3,3-d
14、iaminobenzidine,二氨基联苯胺)作用反应产物呈棕褐色。 HRP+H2O2 HRPH2O2+DH2(还原型供氢体) HRP+2H2O+D(氧化型供氢体),组织抗原,抗体,标记物,直接标记法,DAB,显色原理,抗生物素-过氧化物酶复合物技术(avidin-biodin-peroxidase complex technique, ABC技术) 1 原理 抗生素(avidin又称卵白素或亲和素)是一种糖蛋白,分子量为68KD,与生物素有特殊的亲和力(亲和常数为1015M-1),这种特殊的结合是不可逆的,同时又不影响彼此的生物活性。,由于抗生素分子有4个相同的亚基,是生物素的结合位点,这样
15、它就可以同时与带有生物素分子的大多数蛋白质相结合(包括抗体和酶),使抗生素和生物素标记的酶之间形成大分子复合物,如ABC,而在这个巨大复合物中的过氧化酶活性并不受影响。,1 方法与步骤 ABC法 是先将生物素与过氧化物酶偶联起来,再将抗生物素与生物素结合的过氧化酶按比例亲和组成抗生物素-生物素-过氧化酶复合物(ABC)从而保证抗生物素保留一定的游离结合位点,再与事先制备的生物素偶联的抗体结合(此抗体为二抗)由于抗生物素有4个生物素的结合位点,所以抗生物素可作为桥梁,将生物素偶联的抗体和生物素偶联的酶联在一起。,亲和素,生物素,辣根过氧化物酶,生物素标记的二抗,ABC复合物,组织上的一抗,ABC
16、过氧化物酶法,生物素-抗生物素系统用于免疫组织化学检测的主要有两种:a.标记抗生物素生物素技术(labeled avidin-biotin technique, LAB),即以生物素标记第一抗体,酶标抗生物素作为第二抗体,利用生物素抗生物素的亲和结合,以显示被检测的抗原; b. 桥式抗生物素-生物素技术(bridged avidin-biotin technique, BRAB),使用生物素分别标记抗体和酶,然后以抗生物素为桥,把两者连接起来,以显示被检测的抗原。,生物素,酶,抗生物素,生物素标记一抗,酶标记抗生物素,标记抗生物素生物素技术,生物素,酶,抗生物素,生物素抗体复合物,生物素酶复合
17、物,以抗生素为桥连接两个复合物,桥式抗生物素-生物素技术(BRAB),重症妊娠中毒症子宫蜕膜IGF-1的表达,重症妊娠中毒症绒毛膜IGF-1的表达,二、 免疫金-银染色法 免疫金-银染色法(immunogold-silver staining, IGSS)是一种较新的免疫组织化学技术。 原理: IGS法是在特异性抗体与抗原结合后,再用金标记的间接抗体或金标记的葡萄球菌A蛋白与特异性抗体Fc段结合。所用的标记胶体金颗粒直径在20nm以上时,可在光镜下见到红色的反应物,这就为免疫金法。,IGSS原理,通过抗原抗体反应沉淀在抗原位置的胶体金颗粒,可吸附大量的还原银原子,并在金颗粒周围形成一个“银壳”
18、,在抗原存在的部位成黑褐色。,组织切片,Ag,Ab,GAb,GP,SP,免疫金银染色法,三、 铁标记法 四、 免疫荧光染色法 原理:在已知的抗体或抗原分子标记上荧光素,再与其相应的抗原或抗体起反应,所形成的免疫复合物上带有一定的荧光素,在荧光显微镜下即可观察到待测的抗原或抗体。 五、 双重或多重免疫染色法 是在同一张组织切片上同时进行或先后显示两种或两种以上的抗原成分。可以在同一个标本上同时了解不同细胞或组织与相关抗原的相互关系。,胶体铁显示淋巴细胞的粘多糖,免疫荧光染色,染色对照与非特异性染色 一、 染色对照 免疫组织化学必须设对照组,包括阳性对照和阴性对照。,(一) 阳性对照 用已知含有靶
19、抗原的组织切片与待测切片同步进行免疫染色,前者结果为阳性,称为阳性对照。每一批试验,每一个浓度都必须作阳性对照。阳性对照的必要性: 1 可证实靶抗原的存在与否; 2 可检测所用抗体、试剂、染色步骤是否可靠; 3 可排除待检测片的假阴性的结果; 4阳性对照如果出现了阴性,说明可能在抗原保存、抗体效价、或染色等某一方面存在问题,需要改正后再重新做试验。,阴性对照 阴性对照亦是不可缺少的环节。包括几种:,无靶抗原对照,空白对照,替代对照,吸收试验 用过量的纯化抗原与相应的第一抗体充分反应,使抗原上的结合位点全部与抗体结合,这种对抗原吸收饱和了的抗体不再能与组织内的抗原起反应,用这种抗体再进行免疫染色
20、,其结果为阴性。如果再出现阳性说明抗体不纯。,抑制试验 用于检测抗原、抗体的特异性。 既先将未标记的第一抗体滴加在组织切片上进行充分反应,再用标记的第一抗体滴加同一组织切片上进行第二次免疫染色,结果为阴性或明显减弱。说明第一次的免疫染色,因为标记的特异性抗血清已经先与切片上的靶抗原结合,所以第二次免疫染色时,后加的标记抗体不能再与靶抗原结合,故呈阴性结果。,未标记抗体,标记抗体,抑制试验,抗原,二、 非特异染色及其清除 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性反应来显示抗原或抗体的定位。因此,凡是不属于特异染色的一切染色都属于非特异性染色,它们可造成“假阳性”结果必须进行清除。,非特异性染色的原因很
21、多: 可以是靶细胞、组织的内在干扰; 可以是标记物本身的干扰; 抗体自身的干扰; 抗体与靶细胞组织相互的干扰; 因此,清除非特异性染色对于提高免疫染色效果和正确评价免疫结果十分重要。,例如: 内源性过氧化物酶 体内的某些细胞组织内都含有过氧化物酶,如中性粒细胞中的髓过氧化物酶、单核细胞、嗜酸粒细胞和组织含有的过氧化物酶,都可与过氧化氢反应,使DAB还原为棕色产物,与真正的免疫酶法的棕色产物相混淆,造成假阳性结果。所以在染色前应进行封闭,去除内源性过氧化物酶的活性。,细胞凋亡的研究方法,第一章 细胞凋亡研究方法的选择 研究方法的分类: 一、根据方法的定性和定量特性分类,只能定性的方法,定量或半定
22、量的方法,二、根据是否能将凋亡和坏死区分开分类 1不能将凋亡和坏死区分开 原位末端标记法,PI单染色法流式细胞仪检测等。 2能将凋亡和坏死区分开 琼脂糖凝胶电泳,形态学观察(特别是透射电镜是区别凋亡和坏死最可靠的方法),Hoechst33342PI双染色法流式细胞仪检测,Annexin VPI双染色法流式细胞仪检测等。,三、根据样本来源不同选用不同的方法分类,组 织,培 养 细 胞,第二章 富集或分离凋亡细胞 一、利用死、活细胞对胰蛋白酶和DNA酶的敏感性差异 (一)原理 1.活细胞对胰蛋白酶和DNA酶不敏感,活细胞具有完整细胞膜结构,对细胞具有保护作用。 2.死细胞细胞膜受损,细胞极易被二酶
23、消化。,(二)材料 1胰蛋白酶(Trypsin) 浓度为05,以Hanks液配制,30存放。 2脱氧核糖核苷酸酶(DNase) 浓度为20ul/ml,以Hanks液(内含Ca2+,Mg2+)配制,30存放。 (三)方法 1离心收集细胞(1000-2000rmin,510min,实体瘤或组织必须先机械分散),以Hanks液配制成02ml悬液(106细胞)。 2加100ul DNase I(终浓度67ug/ml),37 温育15min,再加入100ul胰蛋白酶(终浓度125mgm1),37继续温育30min。 3. 加5ml含10小牛血清的Hanks液终止Trypsin及DNaseI酶反应,离心收
24、集细胞。 4以Hanks液洗涤2-3次后,细胞重悬于Hanks液备用。,本法富集细胞80-90以上排斥台盼蓝及Propidium Iodide(P1)染色的细胞为活细胞,或早期凋亡细胞,适用于凋亡细胞的进一步分析,如固定后涂片或制作成电镜切片观察形态,荧光染色进行流式细胞光度学分析等。,凋亡细胞具有完整细胞膜结构,排斥胎盘兰染色,坏死细胞被胎盘兰染色,坏死细胞细胞膜受损,易受酶的消化,二、percoll密度梯度离心法 (一)原理:Percoll是一种密度梯度介质,由聚乙烯吡咯烷酮包裹的硅胶颗粒组成,不粘附细胞膜,对细胞无毒性,可形成等渗、均一的密度梯度。由于凋亡细胞全面固缩、浓聚而密度增高,因
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